白花敗醬草乙醇提取液的抑菌作用及其穩(wěn)定性研究

戴聰杰 林培慶

（泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362000）

白花敗醬草乙醇提取液的抑菌作用及其穩(wěn)定性研究

戴聰杰 林培慶

（泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362000）

采用杯蝶法研究白花敗醬草乙醇提取液的抑菌作用，以及溫度和紫外光因素對其抑菌活性的影響。結(jié)果表明：白花敗醬草提取液的最小抑菌濃度（MIC）位于125～250mg/mL。在溫度23～160℃，紫外照射時間10～50min提取物均有較高的抑菌活性，表明白花敗醬草乙醇提取液的抑菌活性具有很好的熱穩(wěn)定性和紫外光穩(wěn)定性。

白花敗醬草；抑菌作用；最小抑菌濃度（MIC）；穩(wěn)定性

敗醬草 （Herba Patriniae），俗名苦菜，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］。其記載為“敗醬味苦平，主暴熱火瘡，赤氣，疥搔，疽痔，馬鞍熱氣，一名鹿腸?！痹凇缎滦薇静荨罚?］中記載“此藥不出近道，多生崗嶺間，葉似水蓖及薇銜，叢生，花黃，根紫色，其葉殊不似稀簽也?！睆纳鲜霰静菸淖址治?，可以看出該植物生長于丘陵地帶，葉分裂，花黃色，有敗醬的特殊氣味，這些都與黃花敗醬及其數(shù)種同屬植物相符合。徐炳聲［3］，黃勝白［4］，曹繼華［5］和蔡忠琴［6］先后對敗醬的本草考 證得出：敗醬草主要分為黃花敗醬和白花敗醬兩種。黃花敗茜和白花敗醬因其產(chǎn)地不同，其成分也略有差異。

敗醬草是較常用中草藥，有清熱解毒、祛淤排膿、活血化淤、寧心安神之功效?！吨兴幋筠o典》規(guī)定敗醬草的藥源植物為黃花敗醬 （Patrinia scabiosaefolia Fisch）或白花敗醬（Patrinia villosa）的帶根全草［7］。

食品與飼料在加工和貯藏過程中極易受到微生物的污染，若用較小劑量（在安全范圍內(nèi)）許多處理方法和制劑只能殺死部分微生物；用較大劑量，許多殺菌方法還對食品與飼料的風(fēng)味和質(zhì)地有不良影響，更重要的是會破壞其中的營養(yǎng)成分，降低食品與飼料的營養(yǎng)價值，而且許多制劑還影響人類健康。利用天然植物制取天然生物制劑已成為食品和飼料保藏研究的熱點，白花敗醬以其有清熱解毒、祛淤排膿、活血化淤、寧心安神之功效已備受關(guān)注。但是，多年來國內(nèi)外對白花敗醬的研究與應(yīng)用大多集中在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，或只是作為一味野菜食用。白花敗醬的抗菌消炎作用雖早有報道，但其提取方法和抗菌效率國內(nèi)外研究甚少［8，9］，更別提實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

本試驗探討白花敗醬提取液的抑菌作用及其影響因素，旨在為白花敗醬的深加工及新型安全天然食品和飼料制劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）：泉州師范學(xué)院微生物實驗室提供；

金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、變形桿菌（Proteus spp.）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：福建師范大學(xué)微生物教研室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（又稱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基），培養(yǎng)基的配制采用劉慧的方法［8］。

1.1.3 主要儀器

倒置生物顯微鏡：XS2－1B，重慶光學(xué)儀器廠；

生化培養(yǎng)箱：LRH－250A，廣東省醫(yī)療器械廠；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：CS101－2AB，重慶試驗設(shè)備廠制造；

高速冷凍離心機：TGL－16G，上海安亭電子廠；

立式自動電熱壓力蒸汽滅茵器：LDZX－40Ⅱ，上海申安醫(yī)療器械廠；

超凈工作臺：SHJ－ZP＊，上海凈化設(shè)備廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R502B，上海申生科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 白花敗醬草乙醇提取液的制備 白花敗醬草全草烘干后稱取200g，加體積濃度為70%的乙醇于60℃水浴鍋浸提2次，每次2.5h，過濾，合并兩次乙醇提取液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮（60℃，0.08MPa）至200mL，得到生藥質(zhì)量濃度為1g/mL的敗醬草醇提取液，置4℃冰箱中保存［10］。

1.2.2 懸菌液的制備 在超凈工作臺上進行無菌操作。將各細菌菌苔，劃線接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1d。要用時取一供試菌用5～10mL滅菌生理鹽水洗下菌苔，振蕩均勻制成濃度108CFU/mL菌懸液［11］。

1.2.3 含藥平板的制備 白花敗醬草提取物以500mL/L乙醇為溶劑配置成1 000mg/mL的試驗原液，置4℃冰箱中保存。試驗時，再以TSB培養(yǎng)液按二倍稀釋法配制成500，250，125，62.5，31.25，15.6，7.8，3.9，1.95，0.975mg/mL的系列試驗應(yīng)用液。取各濃度應(yīng)用液2mL加入已融化并冷卻至48℃的TSA瓊脂培養(yǎng)基18mL，混合均勻后傾注于直徑90mm的平板中，制成系列含白花敗醬草提取物濃度分別為50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0.39，0.195，0.097 5mg/mL 的瓊脂平板。試驗中同時設(shè)陽性對照：不加白花敗醬草提取物，只加入經(jīng)標化的菌懸液和等量的TSA培養(yǎng)基；陰性對照：不加菌懸液，只加等量白花敗醬草提取物和TSA培養(yǎng)基；溶劑對照：不加白花敗醬草提取物，只加標化的菌懸液，等量的500mL/L乙醇和TSA培養(yǎng)基。

1.2.4 提取液最低抑菌濃度（MIC）的測定 用微量加樣器吸取各種菌液200μL點種于冷卻后含不同白花敗醬草乙醇提取液濃度的瓊板上涂勻，按上述相同培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。取出肉眼觀察，以無細菌生長的最低藥物濃度作為該白花敗醬草提取物的MIC值。以上步驟重復(fù)3次。

配 制 1 000，875，750，625，500，250，125，62.5，31.25mg/mL不同濃度的白花敗醬草乙醇提取液，以大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，變形桿菌和枯草芽孢桿菌為指示菌，用杯蝶法測定樣品提取液的抑菌效果，試驗重復(fù)3次［12］。

1.2.5 溫度對提取液抑菌效果的影響 取8支試管，在試管中各加入濃度為1g/mL的白花敗醬草乙醇提取液10mL，依次分別置于30，40，60，80，100，120，140，160℃烘箱中熱處理30min，對照樣品為常溫下的提取液樣品。以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為指示菌，用杯蝶法測定熱處理前后樣品的抑菌效果，試驗重復(fù)3次［13］。

1.2.6 紫外線對提取液抑菌效果的影響 取1g/mL白花敗醬草乙醇提取液，將其置于15W紫外燈下20cm距離分別照射10，20，30，40，50，60min后，以原液作為對照，以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為指示菌，用杯蝶法測定處理前后樣品的抑菌效果，試驗重復(fù)3次［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 白花敗醬草乙醇提取液的最小抑菌濃度

由表1可知，白花敗醬草乙醇提取液隨著其質(zhì)量濃度的降低，抑菌效力總體呈現(xiàn)下降的趨勢。其提取液的濃度從1 000mg/mL到250mg/mL為止均能對4種供試菌產(chǎn)生明顯的抑制效果。當降至125mg/mL時，對大腸桿菌金黃色葡萄球菌、變形桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用就消失。

表1 不同質(zhì)量濃度白花敗醬草乙醇提取液對供試菌株的抑菌圈直徑Table 1 Different concentrations of ethanol extract fromPatrinia villosafor the inhibition zone diameter of the strains tested /mm

2.2 熱處理對白花敗醬草乙醇提取液的影響

由表2可知，白花敗醬草乙醇提取液經(jīng)過20～160℃溫度熱處理后對4種供試菌均有明顯的抑菌作用，至160℃時，對4種供試菌均還有抑制，由此說明白花敗醬草乙醇提取液對熱有很好的穩(wěn)定性。

2.3 紫外線對白花敗醬草乙醇提取液抑菌效果的影響

將1g/mL白花敗醬草乙醇提取液經(jīng)紫外光處理后，以枯草芽孢桿菌、大腸桿菌為供試菌，測定其抑菌效力，結(jié)果詳見表3。

由表3可知，隨紫外光處理時間的變化，白花敗醬草乙醇提取液的抑菌活性基本穩(wěn)定，表現(xiàn)出明顯的抑菌效果，當紫外照射時間達到60min后，對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌就失去了抑菌效果。

表2 不同溫度熱處理后白花敗醬草乙醇提取液對供試菌株的抑菌圈直徑Table 2 Different temperatures treated of ethanol extract fromPatrinia villosafor the inhibition zone diameter of the strains tested /mm

表3 不同紫外照射時間的白花敗醬草乙醇提取液對供試菌株的抑菌圈直徑Table 3 Different UV irradiation time treated of ethanol extract fromPatrinia villosafor the inhibition zone diameter of the strains tested /mm

3 討論

3.1 待解決的問題

本試驗探究了敗醬草乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用，今后研究中，要運用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對其在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌和枯草芽孢桿菌中的抑制作用的有效成分進行更深入的研究，天然植物成分直接應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中在國內(nèi)外都很少見［8，9］。

對敗醬草提取物有效部位進行進一步分離提純，提取敗醬草抑菌的有效成分。運用層析和高效液相色譜等方法對提取物的化學(xué)組成進行進一步分析。

3.2 研制白花敗醬草制劑的可行性

（1）穩(wěn)定性：天然制劑不僅要有安全、高效性，而且制劑的穩(wěn)定性也是很重要的。在食品與飼料生產(chǎn)、包裝、儲存、流通過程中不可避免的受到環(huán)境因素的影響，比如溫度、光等。天然制劑是否能發(fā)揮抑菌的效力，是食品與飼料保藏研究的重點之一，更是評價研制天然防腐劑是否具有可行性的標準之一。本試驗通過敗醬草水提取液和乙醇提取液對不同溫度、紫外光抑菌活性穩(wěn)定性的研究，初步證實敗醬草抑菌活性具有良好的光和熱穩(wěn)定性。

在白花敗醬草乙醇提取液的熱處理穩(wěn)定性研究中將最高溫度設(shè)到160℃，其抑菌作用也沒有消失，因此也可以得出白花敗醬草的抑菌成分并不是蛋白質(zhì)，而是其它的成分，為以后的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

（2）經(jīng)濟性：中國敗醬屬植物資源十分豐富、來源廣泛、價格低廉，具備可以大量開發(fā)的條件。本試驗在制備敗醬草提取物工藝中，使用了乙醇提取法。乙醇提取法使用了大量乙醇后又可以用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收，故價格低廉，生產(chǎn)成本低，適于大規(guī)模生產(chǎn)。

1 森立之.神農(nóng)本草經(jīng)［M］.上海：科技衛(wèi)生出版社，1959.

2 唐蘇敬.唐新修本草輯復(fù)本［M］，合肥：安徽科技出版社，1981.

3 徐炳聲.中藥敗醬的原植物研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，1965（8）：49～53.

4 黃勝白，陳重明，徐長卿.本草考證［J］.浙江中醫(yī)藥，1977，3（5）：28～30.

5 曹繼華，周世群.河南省敗醬屬植物資源研究［J］.中藥材，1992，15（9）：11～18.

6 蔡忠琴，楊敏.幾種敗醬制劑的抑菌作用［J］.中藥材，1989（4）：34～36.

7 李珊珊，李洪源，劉電力，等.敗醬草抗呼吸道合胞病毒有效部位研究［J］.中國公共衛(wèi)生，2003，19（6）：702～703.

8 Lyon G D，Reglinski T，Newton A C.Novel disease control compounds：the potential to immunize plants agains tinfection［J］.Plant Pathology，1995，44（2）：407～427.

9 Lorito M，Broadway R M，Hayes C K.Proteinase inhibitors from plants as a novel class of fungicides［J］.Molecular Plant－Microbe Interactions，1994，7（4）：525～527.

10 劉富來，馮翠蘭.仙草對禽大腸桿菌體外抑菌試驗 ［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2008，33（6）：17，43.

11 俞樹榮.微生物學(xué)和微生物學(xué)檢驗［M］.第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1997.

12 王南舟，陳光虹.蜂膠中抑菌活性物質(zhì)的提取及其 MIC的測定［J］.蜜蜂雜志，1993（11）：3～5.

13 黃文，王益，胡筱波，等.竹葉提取物抑菌特性的研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2002，22（1）：68～70.

14 李德舜，李鵬，王臻，等.楊樹菇抑菌活性提取物理化性質(zhì)的初步研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版），2007，42（9）：7～10，15.

Study on antimicrobial actions and stability ofPatrin ia villosacharantia extractive

DAI Cong－jieLIN Pei－qing

（School of Chemistry and Life Science，Quanzhou Normal College，Quanzhou，F(xiàn)ujian362000，China）

Extractive ofPatrinia villosawere detected for its antimicrobial effect，in addition，the influence of temperature and UV on the antimicrobial activity were tested.The results showed the minimum inhibitory concentration of extractive fromPatrinia villosawas between 125mg/mL to 250mg/mL，and it keep the high antimicrobial activity in temperature range of 23～160 ℃，time of ultraviolet radiation range of 10min to 50min.It showed that ethanol extract fromPatrinia villosawere high thermostability and ultraviolet radiation stability.

Patrinia villosaextract；antimicrobial effect；minimum inhibitory concentration（MIC）；stability

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.040

泉州市科學(xué)技術(shù)局重點科技計劃資助項目（編號：2006N2）；福建省高校服務(wù)海西建設(shè)重點項目（編號：A101）

戴聰杰（1966－），男，泉州師范學(xué)院教授，博士。E－mail：congjiedai501＠qztc.edu.cn

2011－08－01