冠突散囊菌子囊孢子破壁方法的研究

易鳳英劉素純，2袁 瀟趙 樂

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

冠突散囊菌子囊孢子破壁方法的研究

易鳳英1劉素純1，2袁 瀟1趙 樂1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

研究萌發(fā)破壁、研磨破壁、浸泡－溫差－振搖破壁等方法對(duì)冠突散囊菌子囊孢子破壁效果的影響。結(jié)果表明：蒸餾水浸泡－溫差－振搖法具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)適用、破壁率高（90.8%）的特點(diǎn)，是冠突散囊菌子囊孢子破壁的理想方法。

冠突散囊菌；破壁率；纖維素酶；振搖

茯磚茶具有獨(dú)特的口感和明顯的調(diào)理人體消化及降脂減肥的功效。冠突散囊菌（eurotium cristatum）是茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌，與茯磚茶獨(dú)特品質(zhì)和保健作用的形成有著密切的聯(lián)系。冠突散囊菌子囊孢子為有性孢子，其孢壁質(zhì)地堅(jiān)韌，耐酸堿，極難氧化分解，因此限制了對(duì)孢子內(nèi)有效營(yíng)養(yǎng)成分的準(zhǔn)確分析。為了探究冠突散囊菌子囊孢子內(nèi)的有效營(yíng)養(yǎng)成分，必須對(duì)孢子進(jìn)行破壁。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)靈芝孢子的破壁技術(shù)進(jìn)行了多方面的探討［1－3］，但對(duì)冠突散囊菌子囊孢子的破壁技術(shù)還未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用機(jī)械、化學(xué)、生物等方法分別對(duì)冠突散囊菌子囊孢子破壁工藝進(jìn)行研究，為冠突散囊菌子囊孢子內(nèi)有效營(yíng)養(yǎng)成分的利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冠突散囊菌子囊孢子：菌種由益陽(yáng)茯磚茶廠生產(chǎn)的茯磚茶中分離純化而來，自行培養(yǎng)，定期收集獲得；

95%乙醇：分析純，湖南師大化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴箱：UWB－20型，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；

分析天平：ALC－110.4型，上海精密儀器儀表有限公司；

光學(xué)顯微鏡：BX51型，廣州思貝舒檢測(cè)儀器有限公司；

恒溫?fù)u床：ZHWY－C2102型，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 萌發(fā)破壁試驗(yàn) 稱取1.00 g冠突散囊菌子囊孢子，放入200 m L三角瓶中，加入50 mL茶葉含量為4%的茯磚茶茶汁，然后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每隔4 h取1 m L，用血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)。

1.3.2 研磨破壁試驗(yàn) 稱取1.00 g冠突散囊菌子囊孢子放入研缽中，再加入適量石英砂進(jìn)行研磨。每研磨30 min后測(cè)定破壁率。

1.3.3 浸泡－溫差－振搖破壁試驗(yàn)

（1）乙醇浸泡－溫差－振搖破壁試驗(yàn)：參考唐維［4］、吳華［5］的試驗(yàn)方法，稱取2份1.00 g冠突散囊菌子囊孢子裝入兩個(gè)200 m L三角瓶中，分別用50 m L 75%和95%的乙醇浸泡，置－18℃冰箱中冷凍1 d后，于60℃水浴鍋中水浴加熱2 h。加入玻璃珠若干（玻璃珠的量或體積應(yīng)超過乙醇體積的1／2），然后放入180 r／min、28℃的恒溫?fù)u床中振搖3 d，每隔1 d測(cè)定破壁率。

（2）蒸餾水浸泡－溫差－振搖破壁試驗(yàn)：此法是在乙醇浸泡－溫差－振搖破壁法的基礎(chǔ)上，將乙醇浸泡替換為蒸餾水浸泡，其他試驗(yàn)步驟與1.3.3（1）相同。

1.4 冠突散囊菌子囊孢子破壁率的計(jì)算

利用血球計(jì)數(shù)的基本原理對(duì)冠突散囊菌子囊孢子破壁率進(jìn)行計(jì)數(shù)［6－7］。通過光學(xué)顯微鏡鑒別孢子的破壁與否：未破壁的冠突散囊菌子囊孢子壁光滑完整、豐滿，個(gè)體形態(tài)一致；破壁后，冠突散囊菌子囊孢子壁不完整、內(nèi)容物呈不規(guī)則塊狀。冠突散囊菌子囊孢子的破壁率按下式計(jì)算：

式中：

R——冠突散囊菌子囊孢子破壁率，%；

A——破壁前完整孢子數(shù)；

B——破壁后完整孢子數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)破壁試驗(yàn)的破壁效果

冠突散囊菌子囊孢子在適宜的條件下經(jīng)過培養(yǎng)，由于萌發(fā)力的作用，其孢子壁逐漸破裂，結(jié)果見表1和圖1。

表1 萌發(fā)破壁試驗(yàn)冠突散囊菌子囊孢子的破壁率Table 1 Broken rate of Eurotium cristatum ascospores in germination experiment

由表1可知，隨著時(shí)間的增加，其破壁率有所提高，但就整體情況而言，破壁效果不理想。

圖1 萌發(fā)48 h后的冠突散囊菌子囊孢子（放大400倍）Figure 1 Germination Eurotium cristatum ascospores after 48 h

由圖1可知，培養(yǎng)48 h后，冠突散囊菌子囊孢子的破壁率依然很低。

2.2 研磨破壁試驗(yàn)的破壁效果

冠突散囊菌子囊孢子經(jīng)過研磨，在摩擦力的作用下，孢子壁被磨破，達(dá)到了一定的破壁效果（表2和圖2）。由表2可知，隨著研磨時(shí)間的增加，破壁率不斷提高，但由于研磨屬于手工操作，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且由于孢子體積微小，要達(dá)到比較高的破壁率十分困難。

表2 研磨破壁試驗(yàn)冠突散囊菌子囊孢子的破壁率Table 2 Broken rate of Eurotium cristatum ascospores in grind experiment

圖2 研磨2 h的冠突散囊菌子囊孢子（放大400倍）Figure 2 Eurotium cristatum ascospores in grind experiment after 2 h

由圖2可知，研磨對(duì)破壁有一定效果，但破壁的效果并不理想，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

2.3 浸泡－溫差－振搖破壁試驗(yàn)的破壁效果

2.3.1 乙醇浸泡－溫差－振搖破壁試驗(yàn)的破壁效果 采用溫差和機(jī)械力的作用對(duì)冠突散囊菌孢子進(jìn)行破壁，在180 r／min、28℃的恒溫?fù)u床中振搖3 d后，無(wú)論是75%還是95%的乙醇都達(dá)到了較理想的破壁效果（表3和圖3～4）。由表3可知，使用75%或者95%的乙醇浸泡對(duì)破壁率的效果幾乎沒有影響。由圖3和圖4可知，經(jīng)75%及95%的乙醇處理3 d后，破壁效果差不多，破壁率都比較高。

表3 75%及95%乙醇浸泡的冠突散囊菌孢子的破壁率Table 3 Broken rate of Eurotium cristatum ascospores in 75%and 95%ethanol

圖3 75%的乙醇處理3 d后的破壁效果（放大400倍）Figure 3 Eurotium cristatum ascospores in 75%ethanol after 3 days

圖4 95%的乙醇處理3 d后的破壁效果（放大400倍）Figure 4 Eurotium cristatum ascospores in 95%ethanol after 3 days

2.3.2 蒸餾水浸泡－溫差－振搖破壁試驗(yàn)的破壁效果 用蒸餾水浸泡后再采用溫差和振搖的方法，同樣可達(dá)到很好的破壁效果。由表4可知，隨著振搖天數(shù)的增加，破壁率也逐步上升，振搖3 d后，破壁率效果已經(jīng)很理想。此法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)方便、破壁率高，是冠突散囊菌孢子破壁的最佳試驗(yàn)方法。由圖5可知，經(jīng)蒸餾水處理3 d后，冠突散囊菌子囊孢子達(dá)到了很理想的破壁效果。

表4 蒸餾水浸泡－溫差－振搖法冠突散囊菌孢子的破壁率Table 4 Broken rate of Eurotium cristatum ascospores in distilled water

圖5 蒸餾水處理3 d的冠突散囊菌子囊孢子（放大400倍）Figure 5 Eurotium cristatum ascospores in distilled water after 3 days

3 討論與結(jié)論

綜合萌發(fā)破壁、研磨破壁和浸泡－溫差－振搖破壁3種方法的破壁效果可以看出，3種方法對(duì)孢子破壁都有作用，但破壁效果各不相同。其中，萌發(fā)破壁試驗(yàn)操作較簡(jiǎn)單，但破壁效果最差；研磨破壁的破壁率比萌發(fā)破壁的破壁率要稍高，但依靠手工研磨費(fèi)時(shí)費(fèi)力且破壁效果不佳；采用浸泡－溫差－振搖破壁法，無(wú)論是用酒精浸泡，還是蒸餾水浸泡，在振搖后都能達(dá)到很好的破壁效果。由試驗(yàn)可知，振搖前的溫差改變?yōu)槠票谔峁┝艘欢ǖ臈l件，而玻璃珠撞擊產(chǎn)生的機(jī)械力是導(dǎo)致孢子破壁的主要原因。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是用酒精還是用水浸泡，酒精或水的體積與玻璃珠的體積對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有很大的影響：只有當(dāng)玻璃珠的體積不小于酒精或水體積的一半時(shí)，才能獲得良好的破壁效果。這是因?yàn)椴Ａе橐蛑亓ψ饔脮?huì)沉在三角瓶的底部，如果玻璃珠的數(shù)量太少，則很難碰擊到上層的孢子從而影響破壁效果。

采用蒸餾水浸泡－溫差－振搖破壁法，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單方便，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，試劑藥品等材料廉價(jià)，且破壁效果很好，是冠突散囊菌子囊孢子破壁的理想方法。

1 夏志蘭.靈芝孢子粉生物酶破壁技術(shù)的研究［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2005，12（1）：14～18.

2 薛艷華，史權(quán)，龐海河，等.靈芝孢子幾種破壁方法比較分析［J］.植物研究，2004，24（4）：216～218.

3 張守勤，朱俊潔，王長(zhǎng)征，等.靈芝孢子食用方法與破壁技術(shù)研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2004，35（2）：160～162.

4 唐維.花粉破壁方法的研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（2）：86～92.

5 吳華.破壁提取法的靈芝孢子破壁［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：工學(xué)版，2004，34（2）：312～315.

6 韓文瑜.病原細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)［M］長(zhǎng)春：吉林科學(xué)出版社，1992.

7 李淑芳，張志軍，李海德.靈芝孢子破壁技術(shù)的研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，29（9）：195～199.

Research on methods to broken eurotium cristatum ascospores

YI Feng－ying1LIU Su－chun1，2YUAN Xiao1ZHAO Le1

（1.College of food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan410128，China；2.Food Science and Biotechnology，Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan410128，China）

Germination，grind and immersion －temperature －shaking methods were used to research the different effect of broken eurotium cristatum ascospores.Distilled water immersion－temperature－shaking method is simple，economical and efficient，is an ideal way to broken eurotium cristatum ascospores.

eurotium cristatum；broken；cellulase；shaking

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.042

湖南省重大科技專項(xiàng)（編號(hào)：2008FJ1005）

易鳳英（1982－），女，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)研究實(shí)習(xí)員，在讀碩士研究生。E－mail：453064094＠qq.com

劉素純

2011－03－20