毛節(jié)纈草抗抑郁和抗腫瘤活性組分的研究

趙麗輝，張一折，杜 娟，韓德明，田 堅(jiān)，孫秀平

（1.長(zhǎng)春理工大學(xué)國(guó)際納米光子學(xué)與生物光子學(xué)聯(lián)合研究中心，吉林長(zhǎng)春 130022；2.鄭州大學(xué)生物工程系，河南鄭州 450001）

毛節(jié)纈草抗抑郁和抗腫瘤活性組分的研究

趙麗輝1，張一折2，杜 娟1，韓德明1，田 堅(jiān)1，孫秀平1

（1.長(zhǎng)春理工大學(xué)國(guó)際納米光子學(xué)與生物光子學(xué)聯(lián)合研究中心，吉林長(zhǎng)春 130022；2.鄭州大學(xué)生物工程系，河南鄭州 450001）

對(duì)毛節(jié)纈草乙醇滲漉提取的濃縮物和藥材蒸餾獲得的水提液中的活性組分進(jìn)行了分析.分別加水混懸后，通過(guò)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了抗抑郁活性組分；醇提濃縮物加水混懸后用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取、濃縮，各萃取組分通過(guò)MTT比色法測(cè)定了體外培養(yǎng)的Hella細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞的增殖抑制率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：纈草水提取物具有抗抑郁的活性，纈草乙醇提取物乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相及萃取后水相對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用均不明顯；而提取物的氯仿萃取相抗腫瘤作用明顯，且表現(xiàn)出一定的劑量相關(guān)性.

纈草；抗腫瘤；抗抑郁；活性組分

纈草（ValerianaofficinalisL.）為敗醬科纈草屬多年生野生草本植物，多數(shù)可作藥用，根及根莖是主要入藥部位.在中國(guó)和歐洲，該屬植物具有悠久的藥用歷史，其成分多種多樣，且隨著氣候及生態(tài)環(huán)境的不同而有所不同.纈草主要含環(huán)烯醚萜、倍半萜、生物堿和黃酮4大類型化學(xué)成分［1－2］，其中一種新類型天然產(chǎn)物環(huán)烯醚酯類物質(zhì)，經(jīng)藥理研究表明具有鎮(zhèn)靜作用，同時(shí)還具有細(xì)胞毒性和抗腫瘤等多種生物活性［3－4］.本文對(duì)纈草的化學(xué)組分進(jìn)行了抗抑郁和抗腫瘤活性組分活性研究，以為制備毒副作用小甚至無(wú)毒副作用的新型抗抑郁、抗腫瘤藥物提供理論支持.

目前治療抑郁癥、腫瘤的藥物服后不僅有不良的反應(yīng)，還可產(chǎn)生多種危害，長(zhǎng)期服用，可引起依賴性和耐受性，有的還具有成癮性.這就迫切需要盡快開(kāi)發(fā)研制出療效確切，既能抑郁癥、殺傷腫瘤細(xì)胞，且毒副作用又小的國(guó)產(chǎn)抗抑郁癥、抗腫瘤植物藥［5］.中藥抗抑郁癥、抗腫瘤作用具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的特點(diǎn)，可作用于治療抑郁癥、腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)；同時(shí)其毒副作用低，能提高機(jī)體免疫力，不易產(chǎn)生耐藥性，為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)［6－7］.纈草的活性成分也正是我們要篩選的抗抑郁癥、抗腫瘤藥物之一.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和試劑

乙醇溶液（95%）購(gòu)于北京化工廠；PBS液（無(wú)鈣、鎂離子），0.5%胰蛋白酶，3%谷氨酰胺，培養(yǎng)液（RPMI1640＋10%小牛血清），MTT（Sigma，5 mg／m L），甲瓚溶解液（10%十二烷基硫酸鈉），吐溫80等試劑均購(gòu)于鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；安樂(lè)片由四川琦云藥業(yè)有限責(zé)任公司出品；Hella細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室保存.ICR小鼠80只（雌雄各半，體重18～22 g），由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.

1.2 纈草的提取

首先將纈草根粗粉，用15倍（質(zhì)量）95%乙醇滲漉提取，收集滲漉液，在78℃以下減壓回收乙醇，得膏狀物；另取纈草根加水蒸餾5 h，將藥渣水相過(guò)濾、減壓濃縮，得水提濃縮液［8］.

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選取自主活動(dòng)次數(shù)相近的小鼠80只，隨機(jī)分為8組，每組10只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng).其中：

Ⅰ組為陰性對(duì)照組，每日以生理鹽水0.02 m L／g灌胃；

Ⅱ組為陽(yáng)性對(duì)照組，每日以抗抑郁藥安樂(lè)片20 mg／kg灌胃給藥；

Ⅲ，Ⅳ組分別以纈草醇提取物100 mg／kg以及200 mg／kg灌胃給藥；

Ⅴ，Ⅵ組分別以纈草水提取物100 mg／kg以及200 mg／kg灌胃給藥；

Ⅶ組以纈草揮發(fā)油0.5μL／g灌胃給藥.

每個(gè)對(duì)照組均需另加劑量為10 m L／L的乳化劑吐溫80，以利于溶解.連續(xù)給藥10 d.

1.4 纈草乙醇提取物的萃取

稱取纈草乙醇提取物500 g，分3份分別混懸于500 m L水中，分別用適量的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，各萃取3次.合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀依次回收萃取液，得氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物和萃取后剩余水相.

1.5 MTT法

將傳代腫瘤細(xì)胞懸液離心后，用含10%小牛血清的RPMI1640重懸配成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，每孔加入100μL，鋪板使待測(cè)細(xì)胞密度為1 000～10 000個(gè)／孔，隨即加入不同濃度的待試藥液.陽(yáng)性對(duì)照組加入5－氟尿嘧啶（5－Fu），溶劑組加0.9%NaCl溶液，容積均為20μL.培養(yǎng)液中藥物終濃度分別為0.05，0.1，0.15，0.02 g／L.37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)5 d后，每孔加入MTT溶液20μL，孵育4 h后每孔加入DMSO 150μL，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm（630 nm校準(zhǔn)）處測(cè)量各孔的吸光值（D（570）值）.

配制濃度為5 mg／m L的MTT：稱取MTT 0.5 g，溶于100 m L的磷酸緩沖液（PBS）或無(wú)酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細(xì)菌，4℃避光保存.用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT的吸光度最好在0～0.7范圍內(nèi)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量［9］.

2 結(jié)果與分析

2.1 纈草提取物對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響

動(dòng)物持續(xù)灌胃給藥11 d，至第11天時(shí)，給藥30 min后，將小鼠放入水深為10 cm、高20 cm、直徑10 cm的圓柱形玻璃缸中，每缸一只，水溫25℃，小鼠游泳2 min后，立即開(kāi)始觀察，觀察持續(xù)5 min，記錄此5 min內(nèi)小鼠在水中停止掙扎、或呈漂浮狀態(tài)、或僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面的持續(xù)時(shí)間（不動(dòng)時(shí)間），結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 提取物對(duì)小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間的影響

表1顯示，Ⅲ，Ⅴ與Ⅰ（陰性對(duì)照組）比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；Ⅱ，Ⅳ，Ⅵ，Ⅶ與Ⅰ比較有顯著性差異（P＜0.05）.由此可見(jiàn)，纈草醇提物低劑量組、水提物低劑量組對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著影響；纈草醇提物高劑量組、水提物高劑量組均能縮短小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間.

2.2 纈草提取物對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間的影響

動(dòng)物灌胃給藥12 d，至第12天給藥30 min后，測(cè)懸尾不動(dòng)時(shí)間：將小鼠尾部后1／3處用鐵夾固定，懸吊于鐵架臺(tái)上，使其頭部向下懸掛，出現(xiàn)不動(dòng)時(shí)用秒表計(jì)時(shí)，累計(jì)6 min內(nèi)不動(dòng)時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2顯示，Ⅲ，Ⅴ與Ⅰ（陰性對(duì)照組）比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；Ⅱ，Ⅳ，Ⅵ，Ⅶ與Ⅰ比較有顯著性差異（P＜0.05）.由此可見(jiàn)，纈草醇提物低劑量組、水提物低劑量組對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著影響；纈草醇提物高劑量組、水提物高劑量組均能縮短小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間.

表2 提取物對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間的影響

綜合表1、表2可知，纈草醇提物高劑量組、水提物高劑量組能縮短小鼠強(qiáng)迫游泳及懸尾不動(dòng)時(shí)間，有抗抑郁作用，具有較大的研究?jī)r(jià)值.

2.3 纈草乙醇提取物抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

顯微鏡下觀察，培養(yǎng)后期溶劑組腫瘤細(xì)胞活躍增殖，全視野密集均勻分布，5－Fu和醇提氯仿層萃取物的腫瘤細(xì)胞明顯稀疏，部分細(xì)胞破碎壞死，尤以大劑量組為甚.加入MTT后，溶劑組鏡下可見(jiàn)大量放射叢狀結(jié)晶，5－Fu和醇提氯仿層萃取物組的結(jié)晶隨濃度加大腫瘤細(xì)胞明顯減少.各試劑組在不同濃度下的光密度值見(jiàn)表3及表4.

表3 MTT比色法測(cè)定纈草提取物對(duì)Hella細(xì)胞的增殖影響

表4 MTT比色法測(cè)定纈草提取物對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的增殖影響

從表3可以看出，纈草乙醇提取物氯仿萃取相與溶劑組（陰性對(duì)照組）比較有顯著性差異（P＜0.05）；纈草乙醇提取物乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相及萃取后水相與溶劑組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；纈草乙醇提取物氯仿萃取相與5－Fu組（陽(yáng)性對(duì)照組）比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）.可見(jiàn)纈草乙醇提取物氯仿萃取相具有抗Hella細(xì)胞活性.

從表4可以看出，纈草乙醇提取物氯仿萃取相與溶劑組（陰性對(duì)照組）比較有顯著性差異（P＜0.05）；纈草乙醇提取物乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相及萃取后水相與溶劑組比較無(wú)顯著性差異（P＞ 0.05）；纈草乙醇提取物氯仿萃取相與5－Fu組（陽(yáng)性對(duì)照組）比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）.可見(jiàn)纈草乙醇提取物氯仿萃取相具有抗骨髓瘤細(xì)胞活性.

3 討論

小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)實(shí)驗(yàn)和小鼠尾懸吊實(shí)驗(yàn)屬于行為絕望實(shí)驗(yàn)，被廣泛用于抗抑郁藥的篩選和評(píng)價(jià)［10－11］.本研究采用了這兩種抗抑郁動(dòng)物模型，以觀察纈草乙醇提取物、纈草水提取物對(duì)小鼠抑郁狀態(tài)行為的影響，結(jié)果顯示纈草醇提物、水提物均不同程度地縮短了小鼠不動(dòng)時(shí)間，其中纈草水提物抗抑郁作用顯著.纈草醇提物高劑量組、水提物高劑量組能縮短小鼠強(qiáng)迫游泳及懸尾不動(dòng)時(shí)間，有抗抑郁作用，具有極大的研究?jī)r(jià)值.

采用MTT比色法［12－13］，以人體宮頸癌細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞，對(duì)纈草乙醇提取物各萃取相的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示纈草乙醇提取物的乙酸乙酯萃取層、正丁醇萃取層和剩余水層對(duì)體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞增殖抑制作用均不明顯；氯仿萃取相抗腫瘤作用顯著，劑量在0.05～0.20 g／L之間抑制作用明顯.

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Studies of activities component of antidepressie and anticancer onValerianaofficinalisL.

ZHAO Li－h(huán)ui1，ZHANG Yi－zhe2，DU Juan1，HAN De－ming1，TIAN Jian1，SUN Xiu－ping1

（1.International Joint Research Center for Nanophotonics and Biophotonics，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022，China；2.Bioengineering Department，Zhengzhou University，Zhengzhou 540001，China）

In this report，obtained ethanol concentrate by using percolation，and waterextract by distillation.Add water after suspension，detect antidepressant active component by the mice in vivo.Using chloroform，ethyl acetate，andn－butanol ordinal extraction，ethanol concentrate add water after suspension，get extract and extraction surplus water phase concentrate.Each extraction is determinede on inhibition rate of Hella cells and mylenoma in vitro by MTT colorimetric.The result shows that water extract has antidepressant activity，ethyl acetate extract phase，n－butanol extractphase and surplus water phase of ethanol extractive has not a significant action in inhibition of cell proliferation.The CHCl3extract phase of ethanol extractive is effective with tumor，and it also shows some of the dose correlation.

ValerianaofficinalisL.；anti－tumor；antidepressie；active component

R 284

360·4010

A

1000－1832（2011）03－0122－04

2011－04－12

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20070902－02）.

趙麗輝（1966—），女，博士，教授，主要從事生物化學(xué)和分子生物研究.

方 林）