鹽度和甜菜堿對(duì)鱸魚BHMT mRNA表達(dá)的影響

錢云霞, 宋娟娟

(寧波大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院, 浙江 寧波 315211)

鹽度和甜菜堿對(duì)鱸魚BHMT mRNA表達(dá)的影響

錢云霞*, 宋娟娟

(寧波大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院, 浙江 寧波 315211)

甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(BHMT, EC 2.1.1.5)催化甜菜堿的甲基轉(zhuǎn)移給高半胱氨酸(Hcy), 而分別生成二甲基甘氨酸和蛋氨酸。利用 RT-PCR和 SMART RACE的方法從鱸魚(Lateolabrax japonicus)肝臟中克隆了BHMT全長(zhǎng)cDNA。該序列全長(zhǎng)1 461 bp, 5'端非翻譯區(qū)72 bp, 3'端非翻譯區(qū)183 bp, 開放閱讀框1 206 bp, 可編碼一個(gè)由 401個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì), 該蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為 44.32 kD, 等電點(diǎn)為 7.21。氨基酸序列分析表明,BHMT具有較高的保守性, 鱸魚BHMT與人、小鼠等 9個(gè)物種的同源性為77%～93%, 其中與黃鱸(Perca flavescens)同源性最高, 為93%。用RT-PCR分析BHMT基因在10個(gè)組織中的表達(dá)結(jié)果表明, 只有在肝、腸和腎中有較高的表達(dá)。 RT-PCR和定量PCR表明, 鱸魚從鹽度25的海水轉(zhuǎn)入鹽度12的海水后, 肝、腸和腎BHMT基因表達(dá)量有增加, 而將鱸魚從鹽度為25的海水轉(zhuǎn)入鹽度為29的海水后, 肝、腸和腎的BHMT基因表達(dá)則減少。腹腔注射甜菜堿可增加鱸魚 BHMT基因在肝、腸和腎三個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量。這些結(jié)果表明, 甜菜堿可誘導(dǎo)鱸魚BHMT 基因表達(dá), 而BHMT在適應(yīng)魚類環(huán)境滲透壓變化中起重要作用。

鱸魚; BHMT; 克隆; 組織表達(dá); 鹽度

甜菜堿化學(xué)名為N-三甲基甘氨酸, 在生物體內(nèi)它是膽堿代謝的中間產(chǎn)物, 廣泛存在于各組織中,在細(xì)胞的線粒體中生成后釋放到胞漿。由于甜菜堿的三個(gè)甲基都是有效的活性甲基, 因而它是體內(nèi)最有效的甲基供體之一(Wettstein et al, 1998)。同時(shí),甜菜堿還是重要的滲透壓調(diào)節(jié)劑。研究表明, 哺乳動(dòng)物的肝臟和腎臟細(xì)胞為保持細(xì)胞體積的穩(wěn)定會(huì)在細(xì)胞高滲收縮時(shí)累積甜菜堿, 在細(xì)胞低滲腫脹時(shí)釋放甜菜堿(Garcia & Burg, 1991; Wettstein et al,1998)。在魚類, 甜菜堿可以使大西洋鮭(Salmo salar)從淡水進(jìn)入海水時(shí)減少鹽度變化的刺激, 當(dāng)魚類的餌料中含有甜菜堿時(shí), 肌肉含水率降低, 保持滲透壓平衡的能力提高(Junnila, 2000)。目前, 甜菜堿在滲透壓調(diào)節(jié)中的作用已經(jīng)在許多生物中得到證實(shí),包括微生物、植物和其它動(dòng)物(Polat & Beklevik,1998.)。

體內(nèi)甜菜堿的代謝分解主要是通過甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Betaine homocysteine methyltransferase, BHMT, EC 2.1.1.5 )催化, BHMT是一種 Zn2+依賴的巰基甲基轉(zhuǎn)移酶(Neece et al,2000), 將甜菜堿的一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移給高半胱氨酸后分別生成二甲基甘氨酸和蛋氨酸(甲硫氨酸)(Sandra et al, 2000), 從而降低高半胱氨酸(也叫同型半胱氨酸)的濃度, 因?yàn)楦邼舛鹊母甙腚装彼峥梢l(fā)心血管疾病(Pajares & Perez-Sala, 2006)。雖然高半胱氨酸可以通過轉(zhuǎn)硫作用生成胱硫醚而排出體外, 但從節(jié)約蛋氨酸的角度出發(fā), 由BHMT催化的高半胱氨酸的再甲基化在蛋氨酸循環(huán)中尤為重要(Pajares &Perez-Sala, 2006)。高半胱氨酸還可由蛋氨酸合成酶(methionine synthetase, MS, EC 2.1.1.13 )催化生成蛋氨酸, 該酶與輔酶 B12結(jié)合, 催化 N5-甲基四氫葉酸的甲基轉(zhuǎn)移到高半胱氨酸上生成蛋氨酸, 因而葉酸缺乏時(shí)補(bǔ)充甜菜堿是治療人類高半胱氨酸血癥的重要手段(Sch?fer et al, 2007)。BHMT基因序列已在許多生物中被報(bào)道(Fisher et al, 2002), 但是魚類 BHMT到目前為止僅見于黃鱸(Perca flavescens)、金頭鯛(Sparus aurata)、大西洋鮭、斑馬魚(Danio rerio)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)等。

鱸魚(Lateolabrax japonicus), 屬鱸形目鮨科鱸屬, 是一種廣鹽性、肉食性的魚類, 因其肉質(zhì)細(xì)美,營(yíng)養(yǎng)豐富, 廣受國內(nèi)外市場(chǎng)青睞, 是我國沿海主要海水養(yǎng)殖魚類之一。本實(shí)驗(yàn)通過PCR和RACE技術(shù)克隆了鱸魚BHMT基因全長(zhǎng), 并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析, 通過RT-PCR方法檢測(cè)了BHMT基因在鱸魚組織中的分布, 同時(shí)檢測(cè)了鹽度和甜菜堿對(duì)鱸魚各組織中BHMT基因表達(dá)的影響, 為今后研究BHMT功能及魚類滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 總RNA的提取和cDNA的合成

克隆基因所用鱸魚取自浙江象山黃避岙養(yǎng)殖場(chǎng), 屬廈門沿海的南方種群, 活體解剖, 快速取出肝臟, 用Trizol法提取總RNA, 用Thermo公司的ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度, 并取1 μg總RNA按照TaKaRa公司的PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA。

1.2 核心片段的獲取

據(jù)已知大西洋鮭、金頭鯛、牙鲆、斑馬魚和黃鱸 BHMT保守序列設(shè)計(jì)引物 BHMT F1：5'GTCATGCAGACNTTCACYTTCT-3'和 BHMT R1：5'-GGTGGCYTCCTTSTGCT GC-3', 以鱸魚肝臟cDNA為模板擴(kuò)增BHMT基因的中間片段。引物均由Generay Biotech公司合成。PCR條件如下：94 ℃預(yù)變性 4 min; 94 ℃ 30 s, 57～55 ℃30 s, 72℃1 min, 各 1 個(gè)循環(huán); 94 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃1 min, 34個(gè)循環(huán); 最后 72 ℃延伸 5 min。使用Beyotime公司生產(chǎn)的凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物, 然后與 pMD18-T載體進(jìn)行連接, 轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞后, 于含氨卞青霉素(終濃度 100 μg/m L)的LB瓊脂平板上37 ℃過夜培養(yǎng), 篩選陽性克隆菌株, 經(jīng)pMD18-T載體通用引物PCR鑒定,正確的克隆要送上海Invitrogen生物有限公司測(cè)序。

1.3 3'RACE擴(kuò)增和5'RACE擴(kuò)增

RACE PCR擴(kuò)增按照 Clontech公司的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit的說明書進(jìn)行。取1 μg肝臟總RNA按照說明書合成3'Ready cDNA和5'Ready cDNA。根據(jù)獲得的中間片段序列,設(shè)計(jì)特異性引物 3'RACE P1：5'-CCTGTGACCTGGCACGAG AAGTAGC-3'和 5'RACE P1：5'-CCTGATGTGGTAAGGCTCAAATCCGC A-3', 分別以3'READY cDNA和 5' READY cDNA為模板,3'RACE P1和5'RACE P1引物, 以及試劑盒提供的通用引物UPM進(jìn)行3'RACE和5'RACE第一輪PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 5個(gè)循環(huán); 94 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 5 個(gè)循環(huán)：94 ℃ 30 s, 68 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 25 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸8 min。以第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍作為模板, 設(shè)計(jì)巢氏引物3'RACE P2：5'-CTGCTGCGGATTTGAGCCTTACC-3'和 5'RACE P2 ：5'-ATGGATGGGCACTTGGGACGACC-3'。再以3'RACE P2、5'RACE P2和試劑盒提供的引物Nest-UPM分別進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性94 ℃ 3 min; 94℃ 30 s, 68 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min, 30個(gè)循環(huán); 最后72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物的回收、測(cè)序方法同1.2。

1.4 鱸魚BHMT基因cDNA序列和蛋白質(zhì)序列的

分析

獲得鱸魚BHMT cDNA全長(zhǎng)序列后, 用Bioedit軟件推測(cè)其編碼的氨基酸序列, 在 NCBI中用BLAST進(jìn)行同源性檢索, 并用MEGA 4中的臨位相聯(lián)法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建BHMT氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。構(gòu)建系統(tǒng)樹所用動(dòng)物及其BHMT序列號(hào)如下：黃鱸(Perca flavescens, ABU63967)、金頭鯛(Sparus aurata,ABF06673)、大西洋鮭(Salmo salar,NP_001133157)、斑馬魚(Danio rerio, NP_001012498)、牙鲆(Paralichthys olivaceus, ABM88795)、非洲爪蟾(Xenopus laevis, NP_001088416)、人(Homo sapiens,NP_001704)、黑猩猩(Pan troglodytes, XP_517686)、小鼠(Mus musculus, NP_057877)、牛(Bos taurus,NP_001011679)。

1.5 鹽度對(duì)鱸魚BHMT表達(dá)的影響

鹽度實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)白色圓桶內(nèi)進(jìn)行, 每桶水體積為 100 L, 水溫(25±0.1)℃, pH 7.2±0.1, 期間不間斷充氣, 實(shí)驗(yàn)用鱸魚平均體重 120 g, 實(shí)驗(yàn)選取 15條平均體重為120 g的鱸魚, 分成3組, 實(shí)驗(yàn)海水鹽度為 25±0.1。實(shí)驗(yàn)開始后, 高鹽組：逐步換入部分曝氣人工高鹽水24 h后鹽度升至29；低鹽組：換入部分曝氣自來水24 h后鹽度降為12；對(duì)照組：換取部分海水鹽度保持在25。再經(jīng)過5 h后,各組取5條鱸魚。實(shí)驗(yàn)期間不投餌, 沒有鱸魚死亡。用Sigma公司生產(chǎn)的MS-222(1:2000)麻醉后快速取出肌肉、心、眼、腦、鰓、肝、腸、腎、脂、脾等10個(gè)組織, 提取總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組鱸魚各組織 BHMT基因的表達(dá)。 RT-PCR跨內(nèi)含子引物為：BHMT F2：5'-TGTGACCTGGCACGAGAAGTAG-3'; BHMT R2：5'-TGTGGTAAGGCTCAAATC CGCA-3', PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為610 bp。以18S作為內(nèi)參對(duì)照, 引物為18S F：5'-GTAGTTCCGACCATAAACGATGCC-3'; 18S R：5'-AGAAGTTGGACGCCGACCGCAC-3', PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為373 bp。18S的擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94 ℃，4 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 28 個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。BHMT基因的擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94 ℃ 4 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 50 s, 72 ℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min。用Gel-Pro Analyzer 4凝膠定量分析軟件分析電泳圖片, 求得的 BHMT基因與18S PCR產(chǎn)物量的比值, 并用此值代表BHMT基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

Real-Time Quantitative PCR檢測(cè)鹽度對(duì)鱸魚肝、腸和腎BHMT mRNA表達(dá)的影響。取各組鱸魚肝、腸和腎 1 μg總 RNA按照 TaKaRa公司的PrimeScript? RT Reagent Kit說明書逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA。BHMT的Real-Time Quantitative PCR引物為：BHMT F3：5'-CTGGGGCACAAATCAACGAG-3'和 BHMT R3：5'-ATGTCTCCCTCTGGTCCGAT G-3'。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 s; 95 ℃ 5 s, 56 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s , 40個(gè)循環(huán); 最后72 ℃延伸10 min, PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為295 bp。作為內(nèi)參對(duì)照β-actin的引物為β-actin F ： 5'-TGTGCAAAGCCGGATTCG-3'和β-actin R ： 5'-CCTCTCTTGCTCTGGGCTTCA-3',PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為142 bp。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 s;95 ℃ 5 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s, 40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增在 Rotor-Gene 6000熒光定量 PCR儀上進(jìn)行。Real-Time Quantitative PCR 結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析, 以確保特異性擴(kuò)增, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中 BHMT基因 mRNA 的拷貝數(shù)。設(shè)定對(duì)照組BHMT在肝臟中的表達(dá)量為1, 根據(jù)BHMT在各組中的表達(dá)相對(duì)量作圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Ttest檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有顯著性。

1.6 甜菜堿對(duì)鱸魚肝、腸和腎BHMT基因表達(dá)的影響

鱸魚大小和養(yǎng)殖條件同 1.5對(duì)照組, 甜菜堿(Sigma公司)以 PBS為溶劑, 注射濃度為：400 mg/kg體重, 注射量為 0.1 mL, 另設(shè) PBS對(duì)照組。鱸魚用MS-222麻醉后腹腔注射。實(shí)驗(yàn)期間鱸魚生活狀態(tài)良好, 無死亡。注射5 h麻醉后解剖鱸魚, 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各4條鱸魚, 取肝、腸和腎組織, 用Real-Time Quantitative PCR檢測(cè)甜菜堿對(duì)鱸魚肝、腸和腎 BHMT基因表達(dá)的影響, 具體方法同1.5。

2 結(jié) 果

2.1 鱸魚BHMT全長(zhǎng)cDNA的克隆和序列分析

利用兼并引物BHMT F1和BHMT R1從鱸魚肝臟cDNA中擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為954 bp的片段, 與預(yù)期大小相符, PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序后經(jīng)BLAST分析確認(rèn)為鱸魚BHMT的核心序列。根據(jù)該核心序列設(shè)計(jì)巢式PCR引物, 分別克隆得到517 bp的3'RACE產(chǎn)物和1 151 bp的5'RACE產(chǎn)物。將獲得的3'、5'末端序列與核心序列拼接最終得到 BHMT基因的全長(zhǎng)cDNA序列。結(jié)果表明, BHMT基因cDNA序列全長(zhǎng)為1 461 bp, 含一個(gè)1 206 bp的開放閱讀框, 73～75 bp處為起始密碼子ATG, 1 276～1 278 bp處為終止密碼子TGA, 編碼一個(gè)由401個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(圖1), 典型加尾信號(hào)AATAAA位于polyA起點(diǎn)上游14 bp。http://ca.expasy.org/tools/線軟件分析表明，該蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為44.32 k、等電點(diǎn)為7.21, 已經(jīng)遞交GenBank, 序列號(hào)為：HQ008859。

2.2 BHMT的同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析

將鱸魚與黃鱸等十個(gè)物種的 BHMT進(jìn)行氨基酸序列 BLAST分析后發(fā)現(xiàn), 鱸魚與同為鱸形目的黃鱸同源性最高, 為 93%; 與鱸形目的金頭鯛、鮭形目的大西洋鮭、鯉形目的斑馬魚、鰈形目的牙鲆也都有較高的同源性, 分別為 91%、83%、82%和80%; 與非洲爪蟾的同源性為80%; 與人、黑猩猩、牛及小鼠的同源性分別為79%、79%、78%和77%。用 http://www.expasy.ch/prosite/分析 BHMT配體結(jié)合位點(diǎn), 發(fā)現(xiàn)三個(gè)(210、292、293)可以與Zn2+結(jié)合的半胱氨酸殘基位點(diǎn), 將鱸魚BHMT的氨基酸序列與人、小鼠和黃鱸氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)這三個(gè)半胱氨酸殘基位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于人和小鼠的第 217、299和300位(圖2)。

用軟件 MEGA 4中的臨位相聯(lián)法(Neighborjoining, NJ)構(gòu)建 BHMT氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3), 其結(jié)果表明, 整棵樹分成兩簇：哺乳類和兩棲類形成一簇, 魚類獨(dú)立成簇。鱸魚與黃鱸、金頭鯛有著較近的親緣關(guān)系, 而與西洋鮭、斑馬魚及牙鲆親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 這與傳統(tǒng)分類學(xué)上結(jié)果相符, 因?yàn)轺|魚、金頭鯛、黃鱸同屬鱸形目。

圖1 鱸魚BHMT全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼的氨基酸Fig. 1 The full-length cDNA and deduced amino acid sequence of BHMT from Lateolabrax japonicus

圖2 人、小鼠、黃鱸和鱸魚BHMT氨基酸序列比較Fig. 2 The Comparison of BHMT amino acid sequences from Homo sapiens, Mus musculus,Perca flavescens and Lateolabrax japonicus

2.3 鱸魚BHMT基因的組織表達(dá)及鹽度對(duì)其表達(dá)

的影響

用RT-PCR分析BHMT基因在鱸魚肌肉、心、眼、腦、鰓、肝、腸、腎、脂、脾 10個(gè)組織中的表達(dá), 結(jié)果只在肝、腸和腎有610 bp的目的條帶出現(xiàn), 且在肝和腎的表達(dá)量明顯高于腸(圖4A)。經(jīng)過29 h的29度高鹽度作用和經(jīng)過29 h的12度低鹽度作用, 鱸魚BHMT基因仍然只在肝、腸和腎三個(gè)組織有表達(dá)(圖4B和4C)。用Gel-Pro Analyzer 4凝膠定量分析軟件分析上述RT-PCR電泳圖, 結(jié)果表明,高鹽度組鱸魚BHMT基因mRNA在肝、腸和腎三個(gè)組織的表達(dá)低于對(duì)照組(鹽度 25度), 而低鹽度組在肝、腸和腎三個(gè)組織的表達(dá)高于對(duì)照組(圖5A)。用定量PCR進(jìn)一步檢測(cè)鹽度對(duì)鱸魚BHMT基因在肝、腸和腎的表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn), 和 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一樣, 高鹽度組鱸魚肝、腸和腎三個(gè)組織BHMT基因的mRNA表達(dá)量顯著下降, 分別是對(duì)照組的 49%(P＜0.05)、81% (P＜0.05)和 28% (P＜0.05)。低鹽度組鱸魚BHMT基因mRNA在肝、腸和腎中的表達(dá)量高于對(duì)照組, 分別是對(duì)照組的 1.38倍(P＜0.05)、1.63 倍(P＜0.05)、1.91倍(P＜0.05), 見圖5B。

圖3 鱸魚與其他物種BHMT氨基酸序列進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of BHMT amino acid sequence ofLateolabrax japonicus and those of other species

圖4 鱸魚各組織BHMT在鹽度刺激后的RT-PCR電泳圖譜Fig. 4 The RT-PCR electrophoresis pattern of Lateolabrax japonicus BHMT after salinity challenge

圖5 鹽度對(duì)鱸魚肝、腸和腎BHMT表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of salinity on the expression of Lateolabraxjaponicus BHMT in liver, intestine and kidney

2.4 甜菜堿對(duì)鱸魚肝、腸和腎BHMT基因表達(dá)的影響

用定量 PCR檢測(cè)甜菜堿對(duì)鱸魚肝、腸和腎組織BHMT基因的表達(dá), 結(jié)果表明，鱸魚在經(jīng)過5 h的甜菜堿作用后, BHMT基因在肝、腸和腎組織中的表達(dá)量均有增加, 分別是對(duì)照組的 2.13倍(P＜0.05)、4.18倍(P＜0.05)和9.59 倍(P＜0.05), 見圖6。

圖6 定量PCR檢測(cè)甜菜堿對(duì)鱸魚肝、腸和腎BHMT表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of betaine on the expression of Lateolabrax japonicus BHMT in liver, intestine and kidney by Real-time quantitative PCR analysis

3 討 論

BHMT是一個(gè)由6個(gè)相同的亞基組成的甲基轉(zhuǎn)移酶, 位于胞漿中, 催化膽堿氧化途徑中甜菜堿的甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng), 使高半胱氨酸甲基化生成蛋氨酸。和另一個(gè)催化 N5-甲基四氫葉酸的甲基轉(zhuǎn)移使高半胱氨酸甲基化生成蛋氨酸的MS一樣, BHMT也具有 Zn2+依賴的硫醇和硒醇甲基轉(zhuǎn)移酶家族的結(jié)構(gòu)特征(Breksa & Garrow, 1999), 即具有G(ILV)NCX結(jié)構(gòu)的基序 A和具有(ALV)X(2)(LV)GGCCX(3)PX(2)I結(jié)構(gòu)的基序 B(Millian & Garrow， 1998;González et al, 2004)。人BHMT的基序A和B分別是GVNCH218和VRYIGGCCGFEPYHI307(Breksa &Garrow, 2002)。研究表明, 人BHMT這兩個(gè)結(jié)構(gòu)基序中的三個(gè)半胱氨酸(217、299和300)與Zn2+結(jié)合后才激活高半胱氨酸, 但如果將其中的任何一個(gè)半胱氨酸進(jìn)行突變，BHMT都將無法與Zn2+結(jié)合而失去催化功能(Pajares & Perez-Sala, 2006)。對(duì)鱸魚BHMT基因cDNA序列分析表明, 鱸魚BHMT由401個(gè)氨基酸組成, 其基序A與人BHMT基序A一樣, 為GVNCH211, 基序B為IRYIGGCCGFEPYHI300,三個(gè)半胱氨酸分別位于 210、292和 293, 與人BHMT的同源性也達(dá)到79%, 推測(cè)我們克隆的鱸魚BHMT是具有催化功能的酶。

BHMT在哺乳動(dòng)物各組織中有廣泛的表達(dá)(Waditee & Incharoensakdi, 2001; Mckeever et al,1991), 主要集中在肝和腎, 在肝中的表達(dá), 甚至占全部蛋白質(zhì)的 0.6%～1.6%(Yamashita et al, 2000;Mckeever et al, 1991)。但BHMT的表達(dá)特征也因生物物種而異, 如人、豬和大鼠在腎中的表達(dá)量就較低(Yamashita et al, 2000), 而羊的胰腺、獼猴的晶狀體中 BHMT均有很高的表達(dá)量(Mckeever et al,1991)。鱸魚BHMT的表達(dá)模式與哺乳動(dòng)物基本一致, 我們用 RT-PCR檢測(cè)鱸魚的肌、心、眼、腦、鰓、肝、腸、腎、脂、脾10個(gè)組織, BHMT只在肝、腸和腎有較高的表達(dá)。

Craig(2004)研究表明, 機(jī)體對(duì)BHMT的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平, 食物是引起其表達(dá)變化的最主要因素之一。當(dāng)喂以蛋氨酸缺乏的食物時(shí), 大鼠肝臟的BHMT mRNA含量和酶活性均有提高(Park &Garrow, 1999)。蛋氨酸含量受到限制時(shí), 食物中增加甜菜堿和膽堿等甲基供體能更大程度地誘導(dǎo)BHMT的表達(dá)(Martin & Finkelstein, 1981), 并且這些甲基供體的吸收量和 BHMT的表達(dá)量之間存在劑量相關(guān)性(Junnila, 2000), 同樣在雞餌料中加入甜菜堿后，BHMT的活性可增加(Craig, 2004)。BHMT是催化分解甜菜堿的, 因而當(dāng)體內(nèi)甜菜堿含量升高后刺激 BHMT基因的表達(dá)量增加(Balinska &Paszewski, 1979)。由于BHMT的啟動(dòng)子上有許多激素的調(diào)控元件, 所以激素的刺激也能引起B(yǎng)HMT表達(dá)的變化, 氫化可的松、皮質(zhì)醇和曲安西龍都能增加BHMT的活性和mRNA水平, 而生長(zhǎng)激素只能誘導(dǎo) BHMT mRNA轉(zhuǎn)錄(Pajares & Perez-Sala,2006)。在不受激素影響的HepG2細(xì)胞系中用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn), 甜菜堿和含硫氨基酸的濃度能改變BHMT啟動(dòng)子活性, 但是它們是如何啟動(dòng)BHMT基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制尚不清楚(Lu et al,2010)。在本實(shí)驗(yàn)中, 鱸魚腹腔注射甜菜堿后, 肝、腸和腎BHMT基因的表達(dá)量都有所上升, 表明魚類跟其他脊椎動(dòng)物一樣, 甜菜堿能改變 BHMT的表達(dá)。

另一個(gè)引起 BHMT表達(dá)變化的因素是環(huán)境滲透壓。豬在吸收高 NaCl后, 其肝臟、腎臟 BHMT表達(dá)降低(Sunden et al, 1997), 體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí),BHMT在滲透壓調(diào)節(jié)中起重要作用(García-Pérez &Burg, 1991), H4IIE細(xì)胞在高滲時(shí), BHMT表達(dá)減少,而在低滲時(shí)增加, 酪氨酸激酶或環(huán)嘌呤核苷酸依賴的激酶會(huì)損害 BHMT對(duì)滲透壓的敏感性(Junnila,2002)。在魚類中也發(fā)現(xiàn)環(huán)境滲透壓能改變 BHMT的表達(dá), 如香魚(Plecoglossus altivelis)從淡水轉(zhuǎn)到海水時(shí), 鰓中BHMT蛋白和mRNA表達(dá)均有下調(diào)(Lu et al, 2010), 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 將鱸魚從鹽度為25的海水轉(zhuǎn)入鹽度為 29的海水后, 肝、腸和腎BHMT基因表達(dá)量顯著下降; 而轉(zhuǎn)入低鹽(12度)后,肝、腸和腎的表達(dá)量都有顯著上升, 從而提高甜菜堿的分解代謝, 降低細(xì)胞內(nèi)甜菜堿的濃度利于適應(yīng)低滲環(huán)境, 顯示BHMT基因在調(diào)節(jié)鱸魚滲透壓的過程中發(fā)揮著重要的作用, 但是魚類BHMT的調(diào)節(jié)機(jī)制是否與哺乳動(dòng)物一樣有相同的激酶途徑參與還有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of salinity and betaine on BHMT mRNA expression inLateolabrax japonicus

QIAN Yun-Xia*, SONG Juan-Juan

(Faculty of Life Science and Biotechnology,Ningbo University,Ningbo315211,China)

Betaine homocysteine methyltransferase (BHMT, EC 2.1.1.5) catalyzes the transfer of a methyl group from betaine to homocysteines (Hcy) to form dimethylglycine and Met, respectively. A full-length cDNA of the BHMT inLateolabrax japonicuswas amplified using RT-PCR and SMART RACE methods. The cDNA of the BHMT inL.japonicusis 1 461 bp in size, with 72 bp 5'-UTR, 183 bp 3'-UTR and 1206 bp ORF, encoding a protein of 401 amino acids with a molecular weight of 44.32 kD and pI 7.21. The sequence analysis indicated that the deduced amino acid sequence of BHMT shared high identity (77% – 93%) with nine other species; the highest was 93% withPerca flavescens. Semi-quantitative RT-PCR was used to characterize the expression of BHMT in ten tissues including muscle,heart, eye, brain, gill, liver, intestine, kidney, adipose tissue and spleen. The results showed that BHMT is only expressed in the liver, intestines and kidney. BHMT mRNA in these three tissues declined after the fish were transferred from sea water to a higher salinity environment and induced when transferred to a lower salinity environment. BHMT gene in liver,intestine and kidney can also be induced after intraperitoneal injection of betaine. Our results show that betaine can induce the transcription of BHMT in fish, and BHMT play pivotal roles in adaptation to osmotic change.

Lateolabrax japonicus; BHMT; Clone; Tissues Expression; Salinity

Q785; Q959.499; Q516

A

0254-5853-(2011)03-0277-08

10.3724/SP.J.1141.2011.03277

2010-08-26；接受日期：2010-11-22

國家自然科學(xué)基金(30671608); 浙江省自然科學(xué)基金( M303345); 寧波市自然科學(xué)基金(2006A610088).?

Corresponding author)，Tel: +86-574-87600169, E-mail: qianyunxia@nbu.edu.cn

錢云霞(1965— ), 女, 副教授, 碩士生導(dǎo)師, 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究