嗜熱四膜蟲五個(gè)hsp70基因的表達(dá)分析

馮立芳, 暢 悅, 袁冬霞 繆 煒

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430072;

2. 浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310012; 3. 中國(guó)科學(xué)院研究生院, 北京 100049)

嗜熱四膜蟲五個(gè)hsp70基因的表達(dá)分析

馮立芳1,2, 暢 悅1,3, 袁冬霞1, 繆 煒1,*

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430072;

2. 浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310012; 3. 中國(guó)科學(xué)院研究生院, 北京 100049)

鑒定得到嗜熱四膜蟲13個(gè)含有完整保守結(jié)構(gòu)域的hsp70基因, 對(duì)其中5個(gè)高度相似且無(wú)內(nèi)含子的hsp70基因進(jìn)行表達(dá)分析。在37 、39 和41 ℃熱激條件下, 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,hsp70-2基因?qū)峒ろ憫?yīng)最敏感。在四膜蟲生長(zhǎng)、饑餓和接合生殖這3種生理或發(fā)育狀態(tài)下, Microarray結(jié)果顯示,hsp70-4基因恒定且高表達(dá); 在熱激條件下,hsp70-4基因的表達(dá)水平隨著溫度的升高而略微增加, 證實(shí)hsp70-4基因?yàn)闊嵝菘讼嚓P(guān)蛋白hsc70基因;克隆的hsp70-4基因全長(zhǎng)2 208 bp, 開放閱讀框長(zhǎng)1 959 bp, 編碼653個(gè)氨基酸。Microarray結(jié)果提示,hsp70-3可能參與四膜蟲饑餓早期(0～12 h)的耐受和接合生殖后期(6～10 h)的新大小核形成, 老大核凋亡等事件;hsp70-5可能參與四膜蟲饑餓晚期(12～15 h)的耐受和接合生殖早期(0～6 h)的小核減數(shù)分裂、小核交換和原核(pronuclear)融合事件。Blast2GO分析表明, 與hsp70-3和hsp70-5共表達(dá)的基因分別參與不同的生物學(xué)過(guò)程, 進(jìn)一步反映了hsp70-3和hsp70-5這兩個(gè)基因在功能上是存在差異的。

嗜熱四膜蟲;hsp70基因; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR; Microarray; RACE; 表達(dá)分析

熱休克蛋白(heat-shock protein, HSP)是生物適應(yīng)環(huán)境變化的一個(gè)重要媒介分子, 溫度、外源有毒化合物、紫外輻射等都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞或機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng), 迅速合成HSP作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配、運(yùn)轉(zhuǎn)和降解等過(guò)程, 以維持細(xì)胞蛋白自穩(wěn), 提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激源的耐受性, 增強(qiáng)抗氧化作用, 使細(xì)胞維持正常的生理功能(S?rensen et al,2003; Saibil 2008)。熱休克蛋白 70(HSP70)是 HSP家族的主要一員, 它是細(xì)胞在應(yīng)激條件下的主要表達(dá)產(chǎn)物, 對(duì)于外源有毒化合物的響應(yīng)也迅速而靈敏(Gupta et al, 2010)。根據(jù)表達(dá)情況,hsp70基因家族可分為兩類：誘導(dǎo)型表達(dá)的hsp70基因(heat shock protein 70,hsp70)和組成型表達(dá)的hsp70基因(heat shock cognate gene,hsc70) (Karouna-Renier et al,2003; S?rensen et al, 2003)。對(duì)生物體hsp70基因家族的研究, 可以更好地認(rèn)識(shí)物種耐受脅迫的機(jī)制(Daugaard et al, 2007), 這在單細(xì)胞生物, 如真菌Chytridiomycete (Blastocladiella emersonii) (Georg &Gomes, 2007); 多細(xì)胞動(dòng)物, 如線蟲Caenorhabditis elegans(Snutch et al, 1988)、果蠅Drosophila melanogaster(Bettencourt & Feder, 2001); 高等動(dòng)物,如人(Daugaard et al, 2007); 植物, 如擬南芥Arabidopsis (Sung et al, 2001)等物種中已展開了研究, 但在原生動(dòng)物中, 尚未有關(guān)hsp70基因家族或亞家族的相關(guān)報(bào)道。

原生動(dòng)物四膜蟲Tetrahymena隸屬于纖毛門(Ciliophora)、寡膜綱(Oligohymenophorea)、膜口目(Hymenostomatida)、四膜蟲科(Tetrahymenidae)、四膜蟲屬(Tetrahymena), 是一種營(yíng)自由生活的單細(xì)胞真核生物(Shen, 1999)。目前, 嗜熱四膜蟲大核基因組測(cè)序工作 (TetrahymenaMacronuclear Genome Project) 已經(jīng)完成(Eisen et al, 2006), 這為從基因組水平鑒定嗜熱四膜蟲內(nèi)hsp70基因家族成員奠定了基礎(chǔ)。此外, 近期構(gòu)建的四膜蟲的全基因組基因芯片分析平臺(tái)(Miao et al, 2009)和在此基礎(chǔ)上建立的四膜蟲基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(TetrahymenaGene Expression Database, TGED, http://tged.ihb.ac.cn),為嗜熱四膜蟲內(nèi)hsp70基因家族成員的功能分析增加了豐富的信息。

關(guān)于四膜蟲hsp70基因的研究主要在于不同熱激條件下hsp70基因的表達(dá)變化規(guī)律(Galego &Rodrigues-Pousada, 1985; Williams & Nelsen, 1997),或是證實(shí) HSP70賦予嗜熱四膜蟲的高溫耐受能力(Hallberg et al, 1984, 1985), 或者是對(duì)hsp70基因上游調(diào)控元件的功能研究等方面(Barchetta et al,2008)。本研究在鑒定嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)hsp70基因家族的基礎(chǔ)上, 對(duì)其中5個(gè)高度相似且無(wú)內(nèi)含子的hsp70基因進(jìn)行表達(dá)分析,并進(jìn)一步探討嗜熱四膜蟲hsp70基因的功能。

1 材料與方法

1.1 四膜蟲細(xì)胞的培養(yǎng)

嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)(SB210株)由美國(guó)加州大學(xué)圣巴巴拉分校Eduardo Orias教授惠贈(zèng), 嗜熱四膜蟲(B2086株和CU428株)由美國(guó)康奈爾大學(xué)Peter Bruns教授惠贈(zèng)。四膜蟲的培養(yǎng)基組分：2% Proteose Peptone (Difco)、0.1% yeast extract(Oxide)、0.2% 葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán))、0.003%Ferric citrate(Sigma), 溶于雙蒸水, 經(jīng) 103 kPa、120 ℃滅菌20 min后冷卻至室溫。取長(zhǎng)勢(shì)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期四膜蟲按總體積的 0.2% (400 μL)接種于20 ml培養(yǎng)基中, 30 ℃連續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.2 嗜熱四膜蟲hsp70基因的鑒定

在 5 μg/L濃度三丁基錫(Tributyltin, TBT)(Acros Organic)處理嗜熱四膜蟲CU428株24 h后,用 cDNA microarray篩選得到 1個(gè)應(yīng)激響應(yīng)基因hsp70 ——TTHERM_00125640 (Microarray數(shù)據(jù)未發(fā)表)。根據(jù)該基因的 ID號(hào), 在四膜蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TGD(http://www.ciliate.org/)中進(jìn)行搜索得到預(yù)測(cè)基因所編碼的氨基酸序列。以此基因的氨基酸序列為基礎(chǔ), 并添加人、酵母和擬南芥的 HSP70序列,對(duì)四膜蟲全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastp搜索(Altschul et al, 1997); 得到的結(jié)果再次對(duì)四膜蟲基因組進(jìn)行Blastp搜索以找到四膜蟲中所有的潛在hsp70基因。兩次所得搜索結(jié)果在 NCBI的 CDD數(shù)據(jù)庫(kù)——Conserved Domain Database (Marchler-Bauer et al,2009)以及Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(Finn et al, 2010)中再次進(jìn)行比對(duì), 對(duì)具有 HSP70保守結(jié)構(gòu)域的基因進(jìn)行鑒定,最后總共得到了 13個(gè)具有完整保守結(jié)構(gòu)域的嗜熱四膜蟲hsp70基因。將這13個(gè)hsp70基因的核酸預(yù)測(cè)序列與嗜熱四膜蟲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(數(shù)據(jù)未發(fā)表)進(jìn)行比對(duì)校正。

1.3 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對(duì)鑒定得到 13個(gè)hsp70基因, 使用 Muscle(Edgar,2004)和 Mafft(Katoh & Toh, 2008)進(jìn)行序列比對(duì), 并輔以手工微調(diào)。接著用 Trimal(Capella-Gutierrez et al, 2009)對(duì)gap超過(guò)80%的氨基酸比對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行刪除。系統(tǒng)發(fā)育樹用FastTree(Price et al,2010)構(gòu)建, 參數(shù)設(shè)置-pseudo、-spr 4、-mlacc 2以及-slownni。我們對(duì)四膜蟲系統(tǒng)發(fā)育樹中一枝含有 5個(gè)高度相似且無(wú)內(nèi)含子的基因進(jìn)行分析, 并將它們分別命名為hsp70-1(TTHERM_01044390)、hsp70-2(TTHERM_00125640)、hsp70-3(TTHERM_01080440)、hsp70-4(TTHERM_00105110)、hsp70-5(TTHERM_00558440)。

1.4 熱/冷激脅迫處理

溫度脅迫采用熱激和冷激兩種方式, 每組設(shè) 3個(gè)平行樣。熱激處理?xiàng)l件為：將裝有1 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期嗜熱四膜蟲(SB210株)的離心管分別在37 ℃、39 ℃和41 ℃的水浴熱激, 經(jīng)過(guò)30 min熱激誘導(dǎo)后于相應(yīng)溫度下離心富集蟲體。冷激條件為：將裝有1 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期嗜熱四膜蟲(SB210株)的離心管分別在15 ℃水浴和0 ℃冰上冷激, 經(jīng)過(guò)30 min冷激誘導(dǎo)后于相應(yīng)溫度下離心富集蟲體。

1.5 RNA提取、cDNA合成、mRNA純化、SMART cDNA文庫(kù)構(gòu)建、5'和3'RACE及產(chǎn)物克隆測(cè)序

從上述步驟(1.4節(jié))熱激處理?xiàng)l件下的嗜熱四膜蟲(SB210株)中提取總RNA, 提取方式參照試劑盒TRIzol Reagent (Invitrogen)的說(shuō)明步驟, 總RNA最終溶于50 μL以DEPC處理過(guò)的雙蒸水中, 分光光度計(jì)(Malcom)和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)總RNA濃度和質(zhì)量?？俁NA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法參見Feng & Miao(2008)。

將5 mL嗜熱四膜蟲(SB210株)在39 ℃熱激1 h后提取總RNA, 接著以PolyAtract? mRNA純化系統(tǒng)(Promega, Madison, WI)按照使用說(shuō)明進(jìn)行磁珠法純化, 純化后的mRNA使用SMART cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(Clontech Laboratories, Inc.)擴(kuò)增合成cDNA文庫(kù)(Guo et al, 2010)。

根據(jù)步驟上述1.2節(jié)中鑒定得到的嗜熱四膜蟲hsp70基因序列, 設(shè)計(jì)擴(kuò)增5個(gè)高度相似hsp70基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物; 根據(jù)SMART cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒提供的接頭全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物 UTR(表 1)。用正向通用引物與反向 hsp70-4引物擴(kuò)增hsp70-4基因5'RACE序列, 用反向通用引物與正向hsp70-4引物擴(kuò)增hsp70-4基因3'RACE序列：2.5 μL 10×buffer, 0.5 μL10 mmol/L dNTP(Fermentas), 0.4 μmol/L 引物, 1 unit Taq酶(BD advantage)混合, 0.5 μL文庫(kù)cDNA模板, 最后用雙蒸水配成25 μL RACE反應(yīng)體系; RACE反應(yīng)按照下列程序進(jìn)行：94 ℃ 1 0 min預(yù)變性, 94 ℃ 3 0 s, 62℃30 s, 72 ℃ 1 min共35個(gè)循環(huán)反應(yīng), 最后于72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物在 1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳后,特異DNA片段用glass milk膠回收試劑盒(Biostar,Canada)回收, 產(chǎn)物連接到 pGEM-T載體(Promega)多克隆位點(diǎn), 之后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞液中, 涂平板挑斑。篩選出的陽(yáng)性克隆菌液交由上海聯(lián)合基因研究院測(cè)序。

表1 RT-PCR擴(kuò)增5個(gè)hsp70基因所使用的引物Tab. 1 Primer sequences used for RT-PCR amplification of 5 hsp70 genes

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以上述步驟1.5節(jié)中得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA 為模板, 用表 1的 hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-4、hsp70-5引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增, 內(nèi)參基因選擇嗜熱四膜蟲18SrRNA基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：2.5 μL 10×buffer,0.5 μL 10 mmol/L dNTP, 0.4 μmol/L 引物, 1.2 μL EvaGreen (Biotium), 1 unit Hot start Taq 酶 (天為時(shí)代), 最后以雙蒸水配成25 μL PCR反應(yīng)體系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min預(yù)變性, 中間40個(gè)循環(huán)的94 ℃ 10 s, 50 ℃ 10 s, 72 ℃ 20 s,70℃讀板1 s, 接著72 ℃ 10 min延伸, 最后制作融解曲線65～90 ℃, 以0.5 ℃/s速率讀取數(shù)據(jù)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣, 用Chromo4?實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad)進(jìn)行擴(kuò)增, 反應(yīng)結(jié)果數(shù)據(jù)由程序 Opticon 2讀取?；虻南鄬?duì)表達(dá)水平用軟件Relative Expression Software Tool進(jìn)行計(jì)算(Pfaffl et al, 2002)。統(tǒng)計(jì)方法采用軟件自帶的 ANOVA法,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析方法參考Feng et al (2007)。

1.7 共表達(dá)基因分析

根據(jù)嗜熱四膜蟲3種典型生理/發(fā)育狀態(tài)(生長(zhǎng)、饑餓和接合生殖)20個(gè)階段的全基因組基因表達(dá)數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)來(lái)源于 TGED), 通過(guò)計(jì)算所有基因表達(dá)譜間的相關(guān)系數(shù)分別得到了四膜蟲hsp70-3和hsp70-5基因的共表達(dá)基因(相關(guān)系數(shù)＞0.9) (Miao et al,2009)。然后對(duì)找到的候選基因用 Blast2GO進(jìn)行g(shù)ene ontology (GO)術(shù)語(yǔ)(term)的注釋, 分析共表達(dá)基因之間的關(guān)系, 進(jìn)而推測(cè)hsp70-3和hsp70-5基因的功能。

2 結(jié) 果

2.1 嗜熱四膜蟲hsp70基因的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

在TBT脅迫條件下用Microarray篩選到一個(gè)應(yīng)激響應(yīng)基因hsp70(TTHERM_00125640), Microarray信號(hào)顯示其表達(dá)上調(diào)4.4倍。以該預(yù)測(cè)hsp70基因所編碼的氨基酸序列為基礎(chǔ), 經(jīng) blast比對(duì)共得到13個(gè)含有完整保守結(jié)構(gòu)域的嗜熱四膜蟲hsp70基因,進(jìn)一步結(jié)合嗜熱四膜蟲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(數(shù)據(jù)未發(fā)表)對(duì)這 13個(gè)基因的剪接位點(diǎn)和核酸序列進(jìn)行校正。

對(duì)鑒定得到的13個(gè)嗜熱四膜蟲hsp70基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 結(jié)果顯示有5個(gè)hsp70基因聚成一個(gè)小的進(jìn)化枝(圖 1), 這 5個(gè)hsp70基因均無(wú)內(nèi)含子,由它們推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)如圖2所示, 兩兩之間的相似度為67.5%～76%。

圖1 最大似然法構(gòu)建的嗜熱四膜蟲hsp70基因家族不同基因型的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Tetrahymena thermophila hsp70 gene family members using a ML method

2.2 熱激條件下5個(gè)hsp70基因的表達(dá)水平變化

在37 ℃、39 ℃、41 ℃熱激條件下,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-4、hsp70-5這5個(gè)基因的表達(dá)水平高于正常生長(zhǎng)時(shí)期的 30 ℃(圖 3)。除hsp70-4外, 其余4個(gè)hsp70基因的表達(dá)水平并不隨著溫度的升高而增加, 在 41 ℃時(shí)它們的表達(dá)水平要低于39 ℃。在37、39、41 ℃這3個(gè)不同熱激條件下,hsp70-2對(duì)熱激響應(yīng)最敏感, 其表達(dá)水平在5個(gè)hsp70基因中是最高的, 分別比對(duì)照組30 ℃時(shí)的表達(dá)水平高12、82和15倍。

2.3 冷激條件下5個(gè)hsp70基因的表達(dá)水平變化

以四膜蟲正常生長(zhǎng)條件 30 ℃為對(duì)照, 分別以15 ℃和0 ℃冷激作為刺激條件, 對(duì)5個(gè)hsp70基因的表達(dá)水平進(jìn)行考察。結(jié)果顯示, 除hsp70-4外, 其余4個(gè)hsp70基因?qū)浼ざ疾豁憫?yīng)(結(jié)果未顯示)。在不同的冷激條件下,hsp70-4基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)為截然不同的規(guī)律：在15 ℃冷激30 min后hsp70-4表達(dá)水平提高了1倍, 但是在0 ℃冷激30 min后hsp70-4表達(dá)水平卻降低了50%(圖4)。

2.4 3種四膜蟲典型生理/發(fā)育時(shí)期下5個(gè)hsp70基因的表達(dá)水平變化

根據(jù)四膜蟲基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Tetrahymenagene expression database, TGED, http://tged.ihb.ac.cn)提供的四膜蟲在 3種典型生理/發(fā)育時(shí)期下的基因表達(dá)情況, 可將5個(gè)hsp70基因分為兩大類：(1) 恒定且高表達(dá)的基因,hsp70-4基因在四膜蟲生長(zhǎng)、饑餓及接合生殖時(shí)期表達(dá)穩(wěn)定且表達(dá)量非常高,Microarray信號(hào)值在32 815～61 446之間; (2) 差異表達(dá)的基因, 為hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-5這4個(gè)基因：① 在生長(zhǎng)時(shí)期,hsp70-3的信號(hào)值在141～209, 有較低的表達(dá)水平, 而hsp70-1、hsp70-2、hsp70-5這 3個(gè)基因不表達(dá)(信號(hào)值＜100); ② 在饑餓時(shí)期的0 h,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3這3個(gè)基因表達(dá)量較生長(zhǎng)后期(～1×106cells/mL)分別調(diào)高42.6、15、33.6倍, 其中hsp70-3基因的信號(hào)值最高,為7 022; 在饑餓時(shí)期的0～12 h,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3表達(dá)水平的變化趨勢(shì)由高至低,hsp70-5幾乎不表達(dá); 在饑餓時(shí)期的12～15 h,hsp70-5表達(dá)水平上調(diào), 而hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3的表達(dá)水平仍持續(xù)下降; 在饑餓時(shí)期的 15～24 h,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-5這4個(gè)基因的表達(dá)都下降; ③ 在接合生殖時(shí)期的0～6 h, 僅hsp70-5高表達(dá);在接合生殖時(shí)期的6～10 h,hsp70-5表達(dá)水平下降了80%,hsp70-3表達(dá)水平迅速上調(diào)16.6倍,hsp70-2表達(dá)水平上調(diào) 2.4倍; 在接合生殖時(shí)期的 10～12 h,hsp70-3表達(dá)水平下降了68.75%, 但hsp70-2表達(dá)水平持續(xù)上調(diào) 2.4倍; 在接合生殖時(shí)期的 12～18 h,hsp70-2表達(dá)水平下降了81.8%,hsp70-1表達(dá)水平上調(diào)2.1倍(圖5)。

圖2 5個(gè)hsp70基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)Fig. 2 Multiple sequence alignment of the HSP70

2.5 嗜熱四膜蟲hsc70基因的克隆

嗜熱四膜蟲hsp70-4基因在四膜蟲的正常生長(zhǎng)條件下即高表達(dá), 而且熱激后其表達(dá)量進(jìn)一步提高,屬于典型的熱休克相關(guān)蛋白hsc70基因。從嗜熱四膜蟲全長(zhǎng) cDNA文庫(kù)中克隆了hsc70基因的全長(zhǎng) cDNA,hsc70無(wú)內(nèi)含子, 其開放閱讀框長(zhǎng)2 208 bp, 編碼653個(gè)氨基酸, 5'和3'非翻譯區(qū)分別為94 bp和155 bp; 在3'非編碼區(qū)存在纖毛蟲特有終止信號(hào)(ATTTA和AATTAA) (Boldrin et al, 2003) (圖6)。

2.6 共表達(dá)基因分析

計(jì)算得到與嗜熱四膜蟲hsp70-3和hsp70-5共表達(dá)的基因分別有18個(gè)和392個(gè), 用Blast2GO對(duì)它們的功能進(jìn)行注釋, annotation結(jié)果分別成功得到10個(gè)(55.6%)和165個(gè)(42.1%)與GO terms相關(guān)的基因, 它們所參與的生物學(xué)過(guò)程分別有16種和113種,其中有8種生物學(xué)過(guò)程是重疊的(圖7)。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較嗜熱四膜蟲5個(gè)hsp70基因在亞致死熱激條件下(37、39及41℃)的表達(dá)水平變化Fig. 3 Comparative expression analysis of 5 hsp70 genes inTetrahymena thermophila treated with heat shock (37,39, and 41℃) using real time quantative PCR

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR考察嗜熱四膜蟲hsp70-4基因在冷激條件下(15 ℃與0 ℃)的表達(dá)水平變化Fig. 4 Comparative expression analysis of hsp70-4 genes in Tetrahymena thermophila treated with cold shock(15℃ and 0 ℃) using real time quantative PCR

3 討 論

3.1 嗜熱四膜蟲內(nèi)存在五個(gè)結(jié)構(gòu)高度相似的hsp70基因

圖5 5個(gè)hsp70基因的表達(dá)譜Fig. 5 Expression profile of 5 hsp70 gene

圖6 嗜熱四膜蟲hsc70基因的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 6 The cDNA and deduced amino acid sequence of Tetrahymena thermophila hsc70 gene

圖7 維恩氏圖顯示與hsp70-3和hsp70-5共表達(dá)基因所參與的生物學(xué)過(guò)程比較Fig.7 Venn-Diagram showing the comparison of biological processes between the co-expressed genes with hsp70-3 and hsp70-5

熱休克蛋白HSP70在細(xì)胞中行使多種功能, 包括蛋白折疊、多聚體的耦合與解離、蛋白跨膜定位、熱激響應(yīng)等, 為順利實(shí)現(xiàn)上述功能, 真核細(xì)胞的基因組往往編碼多個(gè)HSP70蛋白(Lindquist & Craig,1998)。目前在人(Daugaard et al, 2007)、果蠅(Drosophila melanogaster)(Bettencourt & Feder,2001)、線蟲(Caenorhabditis elegans)(Snutch et al,1988)、擬南芥Arabidopsis (Sung et al, 2001)、真菌Chytridiomycete(Blastocladiella emersonii) (Georg &Gomes, 2007)等中均已鑒定到由多個(gè)hsp70成員組成的基因家族。但是有關(guān)原生動(dòng)物hsp70基因家族或亞家族的信息匱乏, 尤其是模式生物四膜蟲中,在大核基因組測(cè)序工作完成前僅對(duì)個(gè)別hsp70的功能進(jìn)行分析(Hallberg et al, 1984; Galego & Rodrigues-Pousada, 1985; Williams & Nelsen, 1997; Barchetta et al, 2008)。

本研究鑒定得到了 13個(gè)具有完整保守結(jié)構(gòu)域的嗜熱四膜蟲hsp70基因, 系統(tǒng)發(fā)育分析表明, 其中有5個(gè)基因聚成一個(gè)小的進(jìn)化枝(圖1)。推測(cè)這5個(gè)基因可能來(lái)源于基因的近期復(fù)制事件, 類似于四膜蟲內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的其它基因家族的進(jìn)化方式(Fu et al,2009)。真核生物細(xì)胞質(zhì)中的HSP70末端4個(gè)氨基酸組成高度保守, 無(wú)論是植物, 如擬南芥, 或是低等生物, 如果蠅, 還是高等動(dòng)物, 如大鼠、牛、人等均由 EEVD組成, 以維持 mRNA的轉(zhuǎn)錄順利完成(Kiang & Tsokos, 1998; Chou et al, 2003)。但在嗜熱四膜蟲內(nèi)這5個(gè)高度相似的HSP70末端4個(gè)氨基酸組成卻為 DEVD, 亦不同于原核生物E. Coli的EEVKDKK, 推測(cè)四膜蟲內(nèi)HSP70成員的具體功能可能有別于其它真核生物。進(jìn)一步對(duì)這5個(gè)hsp70基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì), 發(fā)現(xiàn)N端相對(duì)分子質(zhì)量為 44 kDa的 ATPase功能域(ATP-binding domain)的序列幾乎一致, 而 C端相對(duì)分子質(zhì)量為18 kDa的多肽結(jié)合功能域 (polypeptide-binding domain) 和相對(duì)分子質(zhì)量為10 kDa 的C端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain)的相似度則稍低(圖2)。作為行使 ATP水解活性區(qū)域的 ATPase功能域(Kiang &Tsokos, 1998), 5個(gè)HSP70蛋白序列的高度保守, 推測(cè)它們可能都具有水解ATP的功能; 而行使HSP70定位的C端相對(duì)分子質(zhì)量為18 kDa的多肽結(jié)合功能域 (Wang et al, 1993; Demand et al, 1998)在5個(gè)HSP70蛋白序列中差異較大, 尤其是起自偶聯(lián)作用的相對(duì)分子質(zhì)量為10 kDa的C端結(jié)構(gòu)域(Chou et al,2003)差異更大, 說(shuō)明這5個(gè)蛋白在四膜蟲細(xì)胞內(nèi)行使的具體功能可能是有所差異的。

3.2 hsp70-2對(duì)熱激響應(yīng)最敏感

之前的研究表明, 嗜熱四膜蟲在41 ℃熱激15 min后即可檢測(cè)到hsp70基因的表達(dá)產(chǎn)物, 在41 ℃熱激1 h后HSP70蛋白表達(dá)量趨于穩(wěn)定(Williams &Nelsen, 1997; Hallberg et al, 1985); 但是,hsp70-1至hsp70-5這5個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平在15～30 min達(dá)到最高值, 在 1 h后其表達(dá)量反而下降(Dr.Sabrina Barchetta, personal communication)。因此,本研究采用熱激30 min來(lái)研究上述5個(gè)hsp70基因的表達(dá)水平。

在37 ℃、39 ℃、41 ℃熱激條件下, 5個(gè)hsp70基因的表達(dá)水平均高于正常生長(zhǎng)時(shí)期的 30 ℃, 其中以hsp70-2基因的表達(dá)水平為最高。推測(cè)嗜熱四膜蟲對(duì)熱激的響應(yīng)主要依賴于hsp70-2基因, 其它4個(gè)hsp70基因起到輔助作用。這在酵母胞質(zhì)hsp70基因——Ssa亞家族中已有類似的系統(tǒng)研究,Ssa亞家族的成員之間功能雖然有重疊, 但是每個(gè) Ssa蛋白只在特定條件下行使功能, 其它成員只是起補(bǔ)償作用(Craig et al, 1993)。嗜熱四膜蟲(T. thermophila)是一種迄今為止所有已知四膜蟲屬內(nèi)耐熱能力最高的物種(Nanney & Simon, 2000)。如實(shí)驗(yàn)室常用的梨形四膜蟲(T. pyriformis)在32 ℃即無(wú)法繁殖生存,而嗜熱四膜蟲在40 ℃時(shí)仍能很好地存活(Frankel &Nelsen, 2001)。推測(cè),hsp70-2基因在嗜熱四膜蟲具有高耐熱能力中可能起到主要作用。

3.3 鑒定得到的hsp70-4是一個(gè)熱休克相關(guān)蛋白基因

在以15 ℃和0 ℃冷激條件下, 僅hsp70-4對(duì)冷激有響應(yīng), 其余4個(gè)hsp70基因的mRNA表達(dá)產(chǎn)物均檢測(cè)不到, 說(shuō)明并不是所用的嗜熱四膜蟲hsp70基因?qū)浼び许憫?yīng)。在果蠅中也同樣如此,hsp70Aa對(duì)冷激響應(yīng)最敏感, 而hsp60、hsp67Ba、hsc70-1這3個(gè)基因在冷激條件下無(wú)表達(dá)產(chǎn)物(Colinet et al, 2010)。

考察四膜蟲在 3種典型生理/發(fā)育時(shí)期下的hsp70基因表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)hsp70-4基因在四膜蟲的生長(zhǎng)、饑餓及接合生殖時(shí)期表達(dá)穩(wěn)定, 表達(dá)量非常高; 此外, 在 37 ℃、39 ℃、41 ℃熱激條件下,hsp70-4的表達(dá)水平隨溫度的升高而進(jìn)一步提高,據(jù)此認(rèn)為該基因?qū)儆诘湫偷慕M成型表達(dá)的熱休克蛋白(Karouna-Renier et al, 2003; S?rensen et al,2003), 也稱為熱休克相關(guān)蛋白(heat shock cognate protein, hsc)。這是迄今為止在四膜蟲內(nèi)發(fā)現(xiàn)的首個(gè)hsc70。而hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-5這4個(gè)基因在生長(zhǎng)時(shí)期表達(dá)量低或不表達(dá), 在熱激條件下誘導(dǎo)高表達(dá), 屬于誘導(dǎo)型表達(dá)的熱休克蛋白。

3.4 hsp70-3與hsp70-5在四膜蟲生理/發(fā)育狀態(tài)下

行使不同的功能

在四膜蟲的饑餓初期0 h,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3這 3個(gè)基因的表達(dá)量迅速調(diào)高, 其中以hsp70-3基因的信號(hào)值最高, 而hsp70-5卻不表達(dá);隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng), 在 12～15 h的饑餓階段,hsp70-5的表達(dá)量才開始上升, 但此時(shí)hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3的表達(dá)量都已經(jīng)明顯下降。這說(shuō)明饑餓處理會(huì)誘導(dǎo)四膜蟲hsp70基因的表達(dá)。這與在其它生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象是一致的, 無(wú)論是單細(xì)胞生物, 如酵母, 還是脊椎動(dòng)物, 如露斯塔野鯪魚(Labeo rohita), 饑餓導(dǎo)致它們體內(nèi)的hsp70基因表達(dá)上調(diào)(Chughtai et al, 2001; Yengkokpam et al,2008)。另一點(diǎn)值得注意的是, 不同的饑餓時(shí)間段對(duì)應(yīng)不同的hsp70基因表達(dá), 0～12 h主要是hsp70-3起表達(dá), 12～15 h則是hsp70-5在表達(dá), 提示hsp70-3和hsp70-5這兩個(gè)基因在功能上是有差異的。

Hsp70基因不僅可以被熱激、饑餓等所誘導(dǎo)表達(dá), 而且也會(huì)在發(fā)育時(shí)期表達(dá), 真菌(B. emersonii)的hsp70基因即屬于此類(Bonato et al, 1987)。在四膜蟲接合生殖時(shí)期,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-5的表達(dá)均發(fā)生變化, 其中hsp70-3和hsp70-5的表達(dá)水平最高, 變化最明顯。在接合生殖時(shí)期的0～6 h, 以hsp70-5表達(dá)為主, 此階段四膜蟲細(xì)胞內(nèi)的小核通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生單倍體小核, 并發(fā)生小核交換和原核(pronuclear)融合事件; 在 6～10 h,hsp70-5表達(dá)水平下降, 而hsp70-3表達(dá)水平迅速上調(diào), 此階段四膜蟲細(xì)胞內(nèi)的融合核發(fā)育成新的大核和新的小核, 老大核凋亡(Cole et al, 1997; Cole &Soelter, 1997)。

根據(jù)嗜熱四膜蟲3種典型生理/發(fā)育狀態(tài)(生長(zhǎng)、饑餓和接合生殖)20個(gè)階段的全基因組基因表達(dá)數(shù)據(jù), 計(jì)算得到與hsp70-3共表達(dá)的基因有18個(gè), 其中10個(gè)是與GO terms相關(guān)的基因, 參與16種生物學(xué)過(guò)程; 與hsp70-5共表達(dá)的基因有 392個(gè), 其中165個(gè)是與GO terms相關(guān)的基因, 參與113種生物學(xué)過(guò)程。對(duì)這兩類基因各自所參與的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行比較, 發(fā)現(xiàn)其中有8種過(guò)程是重疊的, 涉及DNA代謝、DNA修復(fù)、翻譯后蛋白修飾、蛋白修飾、胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸、離子運(yùn)輸、磷酸化、羧酸代謝過(guò)程等,這些生物學(xué)過(guò)程可能與四膜蟲受饑餓脅迫或接合生殖時(shí)期細(xì)胞分化、發(fā)育是相關(guān)的。進(jìn)一步對(duì)這兩類基因有差異的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行比較, 發(fā)現(xiàn)與hsp70-3共表達(dá)的基因主要參與脂肪酸氧化、脂肪酸代謝、脂肪酸分解、羧酸分解、脂修飾、脂氧化、細(xì)胞脂肪分解等過(guò)程; 而與hsp70-5共表達(dá)的基因則主要參與細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)控制、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、有絲分裂中期板匯集、有絲分裂M期、減數(shù)分裂、RNA代謝、RNA分解、mRNA代謝等過(guò)程。上述結(jié)果顯示hsp70-3和hsp70-5在饑餓和接合生殖階段的表達(dá)譜顯著不同, 以及與它們共表達(dá)基因所參與的生物學(xué)過(guò)程亦存在差異, 說(shuō)明hsp70-3和hsp70-5這兩個(gè)基因在功能上是存在差異的。

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Expression analysis of 5hsp70genes inTetrahymena thermophila

FENG Li-Fang1,2, CHANG Yue1,3, YUAN Dong-Xia1, MIAO Wei1,*

(1. Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation,Institute of Hydrobiology,theChinese Academy of Sciences,Wuhan430072,China;
2.College of Food Science and Biotechnology,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou310035,China;3.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China)

Thirteenhsp70genes with complete conserved domains were identified inTetrahymena thermophila, and expression of five similar and non-intronhsp70genes were analyzed. Under heat shock conditions of 37, 39 and 41oC,hsp70-2mRNA had the highest relative expression level, suggesting it is closely related to heat shock. The basal level of constitutiveT. thermophilahsp70-4gene was high during 20 physiological/developmental stages of growth, starvation and conjugation, and it changed little upon exposure to heat shock: evidence thathsp70-4is an hsc70 gene. Thehsp70-4cDNA is 2 208 bp long, and contains an open reading frame of 1 959 bp encoding 635 amino acids. Microarray data indicated thatT. thermophilahsp70-3gene probably participated in early starvation (0–12 h) stress and late conjugation(6–10 h) events, such as new macronuclear and micronuclear anlagen formation and old macronuclear elimination.However,hsp70-5gene possibly participates in late starvation (12–15 h) stress and early conjugation (0–6 h) events such as micronuclear meiosis, micronuclear exchange and pronuclear fusion. Blast2GO indicated that they participated in dissimilar biological processes, suggestinghsp70-3andhsp70-5perform different functions.

Tetrahymena thermophila; Real time quantitative PCR; Microarray; RACE; Expression analysis

Q959.117; Q786

A

0254-5853-(2011)03-0267-10

10.3724/SP.J.1141.2011.03267

2010-10-13；接受日期：2011-02-22

中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新項(xiàng)目(KSCX2-EW-G-6-4); 國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目(31071993)?

Corresponding author)，E-mail: miaowei@ihb.ac.cn; miaowei530@yeah.net