PTPIP51、p-Raf-1 及ERK1/2 在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)

肖玉霞， 邵樂南， 黃梅靖， 李 偉， Ishfa Hague

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院口腔頜面外科， 武漢 430030

口腔癌是世界范圍內(nèi)第6 大常見癌癥，其中90%以上的口腔惡性腫瘤是口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），口腔鱗狀細(xì)胞癌具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。目前對于口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲與轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚不明確。

PTPIP51（protein tyrosine phosphatase interacting protein 51）是新近發(fā)現(xiàn)的一種進(jìn)化保守蛋白，是序列相似性家族FAM 82 中成員，被命名為FAM82C。PTPIP51 在細(xì)胞內(nèi)可通過不同的信號通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移的過程[1]。

Raf-1 是近年來研究較為廣泛的一個癌基因表達(dá)產(chǎn)物， 是多種信號通路的樞紐。以往研究發(fā)現(xiàn)PTPIP51 在細(xì)胞中可能與Raf-1 蛋白結(jié)合并通過Ras/Raf/M EK/ERK 通路使細(xì)胞形態(tài)改變，并促進(jìn)細(xì)胞遷移、運(yùn)動，在惡性腫瘤中可能具有促進(jìn)腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的作用[2]。ERK1/2 是通路下游蛋白，該蛋白活化能夠磷酸化很多轉(zhuǎn)錄因子如Ets-1，c-Jun，c-Myc，p90Rsk及間接活化NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子?？纱龠M(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)血管生成等[3]。

本研究通過觀察PTPIP51 蛋白與p-Raf-1 蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁正常口腔黏膜組織中的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位，并檢測PTPIP51 與E RK1/2基因mRNA 在口腔鱗狀細(xì)胞癌與相應(yīng)的癌旁正常口腔黏膜組織的表達(dá)情況， 分析PTPIP51 影響Ras/Raf/M EK/ERK 通路與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展以及侵襲、轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

經(jīng)患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會通過，收集本院2009 年6 月～2010 年9 月手術(shù)切除的32 例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和32 例相應(yīng)的癌旁正?？谇火つそM織（距腫瘤組織0.5 cm 以上，經(jīng)蘇木精-伊紅染色確定）標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療或者化療。所取病例標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切除并進(jìn)行標(biāo)記后分兩部分，一部分置于甲醛固定過夜后進(jìn)行石蠟包埋、切片備用；另一部分立即置于液氮保存?zhèn)溆谩Ｈ坎±g(shù)后均進(jìn)行病理檢查證實(shí)。其中，舌鱗狀細(xì)胞癌10例，頰鱗狀細(xì)胞癌10 例，唇癌5 例，牙齦癌5 例，口底癌1 例，腭鱗狀細(xì)胞癌1 例；男性21 例，女性11例；年齡30 ～79 歲，發(fā)病年齡中位數(shù)56.3 歲。病理分級:高、中分化26 例，低分化6 例。按國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2002 年修訂的唇及口腔癌TNM 分期，Ⅰ～Ⅱ期17 例， Ⅲ～Ⅳ期15 例。其中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19 例。

1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙標(biāo)熒光染色試劑、免疫組化試劑及實(shí)驗(yàn)方法 鼠抗人PTPIP51 多克隆抗體purified M axpab mouse polyclonal（B01P）（Abnova， USA）， 兔抗人p-Raf-1 多克隆抗體（Ser338/Tyr341）[4]-R、IgGFITC 熒光標(biāo)記羊抗兔多克隆抗體，熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG-TRITC 多克隆抗體（Santa C ruz， USA），DAPI（上海奔大），SP 免疫組化試劑盒及DAB 顯色試劑盒（武漢博士德）。

為觀察2 種蛋白在同一細(xì)胞內(nèi)的定位，采用免疫熒光雙標(biāo)記法激光共聚焦顯微鏡讀片并攝片。免疫熒光雙標(biāo)記法實(shí)驗(yàn)簡要步驟:將組織蠟塊切成3～5 μm 厚的組織切片，脫蠟至水，蒸餾水及PBS 沖洗，微波進(jìn)行抗原修復(fù)30 min，PBS 漂洗后滴加山羊血清封閉15 min， PBS 漂洗，按濃度1 ∶300 及1 ∶200將鼠抗人PTPIP51 多克隆抗體及兔抗人p-Raf-1 混勻并滴加于玻片標(biāo)本， 4 ℃冰箱孵育過夜。第2 天取出，PBS 漂洗后滴加濃度均為1 ∶200 混勻的羊抗鼠多克隆抗體IgG-T RITC 及羊抗兔多克隆抗體IgG-FITC，其中T RITC 標(biāo)記羊抗鼠多克隆抗體IgG 與鼠抗人PTPIP51 多克隆抗體特異性結(jié)合，發(fā)紅色熒光；FITC 標(biāo)記羊抗兔IgG 與兔抗人p-Raf-1 多克隆抗體特異性結(jié)合，發(fā)綠色熒光。室溫孵育30 ～60 min，PBS 漂洗后滴加DAPI 室溫孵育30 min。避光，30 min 內(nèi)在激光共聚焦倒置顯微鏡下觀察并攝片。所有細(xì)胞核顯示藍(lán)色熒光，陽性細(xì)胞顯示紅色或綠色熒光。為進(jìn)一步觀察陽性細(xì)胞的細(xì)胞類型及蛋白著色部位，對其陽性標(biāo)本PBS 漂洗后進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，方法參照試劑盒說明書；同時取其連續(xù)切片進(jìn)行PTPIP51 蛋白的免疫組化染色，鼠抗人PTPIP51 多克隆抗體的工作濃度為1 ∶300，方法參照SP 試劑盒說明書，DAB 顯色后，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，普通光學(xué)顯微鏡讀片并攝片，陽性細(xì)胞是胞質(zhì)或胞核內(nèi)有棕黃色顆粒細(xì)胞。

1.2.2 Real-time PC R 實(shí)驗(yàn)試劑及實(shí)驗(yàn)方法 RN A 提取試劑T rizol（Invitrogen， USA），逆轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒ReverT ra Ace-α-、實(shí)時熒光定量試劑盒SYBR Green Real-time PC R M aster M ix（TO YOBO，Japan）。PC R 所用引物委托TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計并合成，PTPIP51 引物序列上游5′-GGAGCTGCCAGATGTCACGA-3′， 下游5′-ATCAAGTCATGAAGGCCAGTGAAAC-3′， 擴(kuò)增產(chǎn)物長度為108 bp；ERK1/2 引物序列上游5′-GCAAGCACTACCTGGATCAGCTC-3′， 下 游 5′-TCGGGCCTTCATGTTGATGATA -3′， 擴(kuò)增產(chǎn)物長度95 bp；β-actin 引物序列上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，擴(kuò)增片段長度為186 bp。

實(shí)驗(yàn)步驟:32 例口腔鱗狀細(xì)胞癌及配對的癌旁正?？谇火つそM織常規(guī)Trizol 提取總RNA，紫外分光光度計測量產(chǎn)物純度及濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，吸取2 μL 總RNA 加入20 μL 反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其中5×PT Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL ，Oligo（dT）201 μL， RN ase inhibitor 1 μL， ReverTra Ace 1 μL ，Rnase free H2O 補(bǔ)足容量。用上一步的反應(yīng)產(chǎn)物cDNA 為模板進(jìn)行Real-time PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL， 其中上、下游引物各8 pmol，ddH2 O 6.4 μL，SYBR Green M ix 10 μL，上一步反應(yīng)產(chǎn)物2 μL 。反應(yīng)分為3 個階段，第1 階段:95 ℃熱啟動30 s；第2 階段:95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，進(jìn)行40 個循環(huán)，在每個循環(huán)結(jié)束后收集熒光，作擴(kuò)增曲線；第3 階段:95 ℃30 s，55 ℃30 s，95 ℃30 s，在55 ～95 ℃每隔0.3 s 收集熒光，作熔解曲線，驗(yàn)證產(chǎn)物的特異性。并在1.5%瓊脂糖凝膠電泳后紫外線燈觀察并攝片。根據(jù)第2 階段的CT 值通過ΔCT =C T目的基因-CT管家基因，計算目的基因相對管家基因表達(dá)強(qiáng)度， 2-ΔΔCT（ΔΔCT =ΔCT腫瘤組-ΔC T正常組）分別計算2 種基因在腫瘤組織的相對表達(dá)量[5]。當(dāng)2-ΔΔCT＞1 時，目的基因的表達(dá)上調(diào)，反之表達(dá)下降。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光、免疫組化及病理學(xué)檢查結(jié)果

免疫熒光顯示PT PIP51 與p-Raf-1 蛋白均在口腔鱗狀細(xì)胞癌的癌巢周邊部位細(xì)胞及部分脈管壁內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)陽性（圖1A ～C，圖2A ～C），且2 種蛋白多為共定位表達(dá)（30/32），癌巢中央腫瘤細(xì)胞多數(shù)為陰性表達(dá)。正常黏膜陽性表達(dá)僅見于上皮下間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)；癌旁正常口腔黏膜組織上皮基底層以上多數(shù)表達(dá)陰性，部分基底層細(xì)胞弱陽性（圖3A ～C）。并附同一張病理切片的蘇木精-伊紅染色結(jié)果（圖1D、2D、3D）。免疫組化進(jìn)一步顯示口腔鱗狀細(xì)胞癌癌巢周圍PTPIP51 陽性細(xì)胞為分裂活躍的腫瘤細(xì)胞，癌巢中央癌細(xì)胞多數(shù)為陰性表達(dá)（圖4）；正常口腔黏膜組織上皮基底層可見部分細(xì)胞PTPIP51 蛋白陽性表達(dá)（圖5）；所有組織均可見間質(zhì)細(xì)胞PTPIP51 蛋白陽性表達(dá)。

2.2 Real-time PCR 結(jié)果

PTPIP51 及ERK1/2 基因mRNA real-time PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:32 例口腔鱗狀細(xì)胞癌及對應(yīng)的正?？谇火つそM織均有PTPIP51 和ERK1/2 及內(nèi)參βactin 基因mRNA 的擴(kuò)增（圖6），32 例腫瘤標(biāo)本與相應(yīng)正常黏膜標(biāo)本PTPIP51 mRNA 相對表達(dá)量為（2.74±0.31）（P ＜0.05），ERK1/2 mRNA 相對表達(dá)量為:（5.14±0.64）（P ＜0.05）（圖7），且2 種基因mRNA 的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r =0.641， P ＜0.05）（圖8）。數(shù)據(jù)顯示腫瘤組的PTPIP51 及ERK1/2 mRNA 表達(dá)水平與患者性別、年齡、及病理分期無關(guān)（P ＜0.05）；與腫瘤TNM 分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組2 種基因表達(dá)水平高于無轉(zhuǎn)移組（P ＜0.05），見表1。

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面-頭頸癌中常見的惡性腫瘤，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示近20 年來口腔癌的5 年生存率僅為50%～55%。腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致口腔癌患者死亡的主要原因[6]。惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是多基因及信號蛋白共同作用的結(jié)果，隨著近代分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞遷移運(yùn)動能力改變、細(xì)胞凋亡失控、腫瘤內(nèi)血管新生等有關(guān)。

PTPIP51 是一種進(jìn)化保守蛋白，在正常人體多種組織及細(xì)胞等均有表達(dá)[7]，在胚胎及胎盤組織和多種腫瘤細(xì)胞也可檢測到該蛋白的表達(dá)[8]。研究發(fā)現(xiàn)該蛋白與14-3-3 蛋白結(jié)合能夠通過Raf-1 介導(dǎo)Ras/Raf/M EK/ERK 通路活化，促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)改變及細(xì)胞的遷移性、運(yùn)動性增加[2]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在正常人類口腔黏膜及口腔鱗狀細(xì)胞癌中均有PTPIP51蛋白表達(dá)，并且在口腔鱗狀細(xì)胞癌中可檢測到PTPIP51 蛋白與p-Raf-1（Ser338/Tyr341）在細(xì)胞內(nèi)多數(shù)共定位表達(dá)。

表1 PTPIP51及E RK1/2 基因mRNA 的表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系（±s）Table 1 Relationship betw een PTPIP51，ERK1/2 mRNA expression and clinicopathological features of OSCC（±s）

表1 PTPIP51及E RK1/2 基因mRNA 的表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系（±s）Table 1 Relationship betw een PTPIP51，ERK1/2 mRNA expression and clinicopathological features of OSCC（±s）

PTPIP51 m RNA ERK1/2 mRNA Clinicopathological featuresn Tumor group/Normal groupP Tum or group/No rm al groupP Age（years）0.5010.396≥50192.72±0.235.97±0.63 ＜50132.61±0.755.03±0.94 Gender0.6100.241 Male212.80±0.155.70±0.77 Female112.69±0.735.11±0.52 Differentiation0.0690.077 Well/Moderately262.48±0.364.79±0.81 Poo rly63.34±0.825.36±0.53 Lymph node metastasis0.0380.028 Positive133.11±0.586.21±0.16 Negative191.37±0.723.80±0.44 TNM stage0.0270.043 Ⅰ-Ⅱ172.29±0.523.11±0.83 Ⅲ-Ⅳ154.31±0.367.24±0.44

Mitogen-activated protein kinases（M APKs）家族在細(xì)胞中能夠傳導(dǎo)多種胞外信號到細(xì)胞核后通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)，控制細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、粘附及細(xì)胞遷移[9]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellullar signal-regulated kinase）ERK1/2 信號通路是MAPKs 家族中研究最為廣泛的成員，研究發(fā)現(xiàn)Ras/Raf/M EK/ERK 通路在70%以上惡性腫瘤中廣泛活化[10]。

惡性腫瘤中常發(fā)生Ras 基因突變，該基因活化可導(dǎo)致蛋白活化異常，活化的Ras 能夠募集Raf 蛋白結(jié)合到細(xì)胞膜并使后者發(fā)生活化， Raf 家族中Raf-1 蛋白表達(dá)最為廣泛，Raf-1 蛋白在細(xì)胞生存、細(xì)胞遷移及腫瘤形成方面具有重要作用已廣泛證實(shí)[11-12]，目前已知Raf-1 有13 個位點(diǎn)可發(fā)生蛋白的磷酸化作用[13]，許多位點(diǎn)如S43，S259 和S621 位點(diǎn)磷酸化可導(dǎo)致蛋白失活，而S338，Y340 和Y341 位點(diǎn)磷酸化能夠活化蛋白[14-15]。磷酸化p-Raf-1（Ser338/Tyr341）能夠磷酸化并活化M EK1 蛋白并介導(dǎo)通路下游蛋白ERK1/2 活化[4]。而ERK 蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞遷移、粘附及向周圍間質(zhì)擴(kuò)展中發(fā)揮重要功能。并且證實(shí)ERK1/2 將活化信號傳到細(xì)胞核后能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡等。以往研究發(fā)現(xiàn)正?？谇火つそM織不表達(dá)p-Raf-1 蛋白，而口腔鱗狀細(xì)胞癌組織可見p-Raf-1 蛋白表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符。本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)PTPIP51 與p-Raf-1 在口腔鱗狀細(xì)胞癌表達(dá)多數(shù)共定位表達(dá)的同時發(fā)現(xiàn)PTPIP51 與ERK1/2 mRNA 在腫瘤細(xì)胞高于癌旁正常黏膜組織，且二者表達(dá)具有相關(guān)性，統(tǒng)計學(xué)分析2 種蛋白的表達(dá)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。推斷PTPIP51 與p-Raf-1 結(jié)合可能通過Ras/Raf/M EK/ERK 通路參與了口腔鱗狀細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。

另外一個參與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)的細(xì)胞信號過程是腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)型（epithelial-mesenchymal transition，EM T），表現(xiàn)為上皮細(xì)胞在與間質(zhì)細(xì)胞相互作用中獲得一些間質(zhì)細(xì)胞特性，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)間質(zhì)化、遷移運(yùn)動能力增加。在惡性腫瘤中表現(xiàn)為癌巢周圍腫瘤細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞特性細(xì)胞梭形改變，排列雜亂及腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動及侵襲性增加等，目前發(fā)現(xiàn)Ras/Raf/M EK/ERK 信號通路參與這一過程[16-17]。該實(shí)驗(yàn)顯示癌巢周圍癌細(xì)胞表現(xiàn)PTPIP51 及p-Raf-1 陽性，而這部分腫瘤細(xì)胞往往發(fā)生形態(tài)間質(zhì)化及具有侵襲及轉(zhuǎn)移能力，即發(fā)生腫瘤細(xì)胞的EM T ，提示2 種蛋白可能參與了腫瘤細(xì)胞的EM T 介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

S tenzinger 等[18]在對PT PIP51 蛋白表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)PTPIP51 在正常皮膚上皮基底層以上表達(dá)陽性，同時發(fā)現(xiàn)該蛋白在皮膚上皮的表達(dá)受RA及1，25（OH）2D3和EGF 調(diào)節(jié)，而后者在正常皮膚上皮均具有促進(jìn)細(xì)胞增殖及分化的重要作用，同時發(fā)現(xiàn)上調(diào)HaCaT 細(xì)胞中PTPIP51 蛋白的表達(dá)可檢測到角蛋白10 及外皮蛋白的表達(dá)增加。推斷PTPIP51 在皮膚上皮細(xì)胞中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化的作用。本實(shí)驗(yàn)免疫組化染色顯示在細(xì)胞增殖旺盛腫瘤細(xì)胞及正常黏膜基底層以上部分上皮細(xì)胞中檢測到PTPIP51 蛋白陽性，同時免疫熒光染色顯示PTPIP51 與p-Raf-1 蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)共定位，結(jié)合real-time PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推斷該蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能。但是正常黏膜上皮基底層以上及鱗狀細(xì)胞癌癌巢中央表達(dá)陰性與Stenzinger 等[1]、Koch 等[19]在皮膚上皮細(xì)胞及皮膚鱗狀細(xì)胞癌的表述不同，推測新蛋白在正?？谇火つず推つw表皮表達(dá)存在差異。

惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的另一個條件是新生血管的充足血供，很多研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤中新生血管密度增加與腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤血管生長的細(xì)胞因子主要有:堿性成纖維生長因子（bFGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和胎盤樣生長因子（PLGF）。Ras 和體內(nèi)鈣離子水平也能調(diào)節(jié)血管生成[20-21]。V EGF-A 在促進(jìn)血管生成方面發(fā)揮最重要的作用，它和相應(yīng)血管內(nèi)皮生長因子受體結(jié)合后通過E RK 及PI3K 等途徑能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞間的滲透性以及毛細(xì)血管新生?，F(xiàn)已知PTPIP51 中的信號配體S rc 激酶活化能夠促使VEGF 破壞VE-cadherin 在附著斑的定位，改變內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性。并且Raf-1 參與了對血管生成的調(diào)節(jié)及活化的ERK1/2 在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞滲透性過程發(fā)揮重要作用[1]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌中PTPIP51 及p-Raf-1 在血管周圍部分免疫細(xì)胞及部分管壁表達(dá)陽性，提示PTPIP51 及p-Raf-1 可能在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移進(jìn)程中參與腫瘤組織內(nèi)的血管新生。

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