Th17 細胞聯(lián)合CD3 + CD8 － IL－21 + T細胞升高與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關系*

張 妍， 崔保霞， 馬道新， 劉 藝， 田永菊， 侯 菲， 張文靜

(山東大學齊魯醫(yī)院1 婦產(chǎn)科，3 血液病研究中心，山東 濟南250012;2 濰坊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 濰坊262500;4 山東省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，山東 濟南250117)

宮頸癌是僅次于乳癌的第二位常見婦女惡性腫瘤，高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是其根本病因［1，2］。但是，HPV 感染后，絕大多數(shù)患者的免疫系統(tǒng)可將病毒清除，只有很少一部分持續(xù)感染者的宮頸損害會經(jīng)由宮頸上皮內(nèi)瘤Ⅰ級(cervical intraepithelial neoplasia I，CIN I)發(fā)展為CIN III 進一步進展為侵潤癌［3］。這就意味著免疫調(diào)節(jié)在HPV 介導的致癌作用中起著很重要的作用。

Th17 細胞是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型CD4+效應性T 細胞，以其特異性的分泌IL－17 而命名。Th17 細胞介導炎性反應，參與自身免疫性疾病、移植物抗宿主等疾病的發(fā)生和發(fā)展，決定疾病的轉(zhuǎn)歸和預后，備受免疫學界的關注［4，5］。而其在腫瘤免疫應答中的表達及作用的報道卻很少且存在爭議。有研究表明，前列腺癌和卵巢癌患者外周血Th17 細胞比例升高，但卻得出了升高的Th17 細胞既促進腫瘤進展又抑制腫瘤進展的結(jié)論［6，7］。而另一研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者與正常人的外周血Th17 細胞比例無明顯差異，但腫瘤組織中分離出的侵潤性T 細胞里Th17 比例卻顯著上升［8］。關于Th17 細胞在宮頸癌中的研究還未見報道。IL－21 是Th17 細胞高表達的一個細胞因子，是IL－2 家族的新成員，Th17 通過自分泌IL－21 的途徑調(diào)節(jié)自身的分化和功能［9］。作為Th17細胞的功能性細胞因子，IL－21 還可以放大和維持Th17 細胞的功能［10］，而IL－17 則不能［4］。為了探討Th17 在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們檢測了宮頸癌患者、CIN 患者以及正常對照外周血中Th17 細胞和CD3+CD8－IL－21+T 細胞的表達情況，并進一步探討它們之間的關系。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑及儀器 藻紅蛋白－ 花青染料5(phycoerythrin－cyanine 5，PE－Cy5)標記的抗人CD3 單抗、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的抗人CD8 單抗、PE 標記的抗人白細胞介素－17(interleukin－17，IL－17)單抗和PE標記的抗人IL－21 單抗均購自eBioscience;佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate，PMA)、離子霉素(ionomycin)和莫能霉素(monensin)均購自Alexis Biochemicals。采用BD Bioscience PharMingenCalibur 流式細胞儀測定淋巴細胞各種熒光素的熒光強度。

1.2 研究對象 2009 年12 月至2010 年6 月山東大學齊魯醫(yī)院收治的宮頸癌患者37 例，年齡34－70歲，平均45 歲;CIN 患者25 例，年齡28－60 歲，平均42 歲，均經(jīng)宮頸活檢或手術病理證實。對照組18例，全部為健康志愿者，年齡26－67 歲，平均42 歲，宮頸細胞學檢查陰性。3 組中年齡無顯著差異。合并糖尿病、高血壓、心血管疾病、妊娠、急慢性感染、結(jié)締組織病或既往有腫瘤病史者排除入選。分期執(zhí)行國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，2000 年)分期標準。入選患者的基本臨床特征見表1 及表2。所有入選患者均為初治，未經(jīng)手術、化療及放射等任何治療。

表1 宮頸癌患者的臨床特征Table 1. Clinical characteristics of cervical cancer patients(n =37)

表2 CIN 患者的臨床特征Table 2. Clinical characteristics of CIN patients(n=25)

本研究獲得山東大學齊魯醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有參與者均知情并簽署知情同意書，然后采集晨起空腹肝素鈉抗凝靜脈血4 mL。

2 方法

2.1 Th17 細胞及CD3+CD8－IL－21+T 細胞的檢測

IL－17 和IL－21 都是胞內(nèi)表達的細胞因子，通過流式技術檢測其含量來反映Th17 和CD3+CD8－IL－21+T 細胞的水平。取肝素鈉抗凝的全血200 μL，加入同體積的不含牛血清的RPMI－1640，再加入PMA (工作濃度25 μg/L)、ionomycin (工作濃度1 mg/L)和monensin (工作濃度1.7 mg/L)，混勻后在37 ℃、5% CO2孵箱中孵育4 h。混勻后分別取100 μL 于3 個流式管中，標記為Th17 細胞管、CD3+CD8－IL－21+T 細胞管和同型對照管。按說明書要求加入PE－Cy5 抗人CD3 單抗和FITC 抗人CD8 單抗，室溫下避光孵育15 min，以標記CD4+T 細胞(CD3+CD8－T 細胞)。用生理鹽水洗滌，固定、破膜后，分別加入說明書推薦劑量的PE 標記抗人IL－17單抗、抗人IL－21 單抗和同型抗體，室溫下避光孵育15 min。生理鹽水洗滌后，PBS 重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，3 組間比較采用方差分析，2 組間的比較用t 檢驗。

結(jié) 果

1 Th17 細胞在CIN 及宮頸癌患者外周血中的比例升高

Figure 1. The levels of circulatory Th17 cells and CD3 +CD8 －IL－21 +T cells in representative cervical cancer (CC)patients，cervical intraepithelial neoplasia (CIN)patients and controls. A:lymphocytes were gated by flow cytometry.B:CD3 + T subsets were gated by flow cytometry. Plots in the internal box represented CD3 + T cells. C，D，E:the proportions of Th17 to CD3 +subsets from representative controls，CIN patients and CC patients，respectively.F，G，H:representative IL－21 expression in CD3 + subsets from controls，CIN patients and CC patients were shown，respectively. The percentages of positive cells were shown in each panel.圖1 Th17 細胞和CD3 +CD8 －IL－21 +T 細胞在宮頸癌、CIN 及正常對照組中的表達

Figure 2. The proportions of CD3 + CD8 － IL－21 + T cells and Th17 cells detected by flow cytometry. ± s. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs cervical cancer;△P ＜0.05，△△P＜0.01 vs CIN.圖2 CD3 +CD8 －IL－21 +T 細胞和Th17 細胞在宮頸癌、CIN和正常人中的比例

在PMA/ionomycin 短時間孵育后，Th17 細胞和CD3+CD8－IL－21+T 細胞在宮頸癌患者、CIN 患者及正常對照者外周血中的比例變化見圖1、2。與正常人［(1.30±0.51)%］相比，Th17 細胞比例在宮頸癌患者［(2.30 ±0.78)%，P ＜0.01］和CIN 患者［(2.05 ±0.82)%，P ＜0.01］明顯升高。CIN 患者與宮頸癌患者Th17 細胞的比較無顯著差異(P ＞0.05)。宮頸癌患者Th17 細胞比例增高的程度與臨床分期呈正相關(P ＜0.05)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管侵潤相關，其比例在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組［(2.97 ±0.51)% vs (2.01±0.85)%，P ＜0.01］和有脈管浸潤組［(3.20 ±0.45)% vs (1.74 ±0.67)%，P ＜0.01］明顯升高，見圖3。Th17 細胞比例與腫瘤的大小、組織學類型、分化程度及浸潤深度無顯著相關性(P ＞0.05)。

Figure 3. The proportion of Th17 cells and its correlation with lymph node metastasis or vasoinvasion in cervical cancer patients. ±s. ＊＊P ＜0.01 vs positive.圖3 宮頸癌患者Th17 細胞比例與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管轉(zhuǎn)移的關系

Figure 4. The correlation between CD3 +CD8 －IL－21 +T cell proportion and lymph node metastasis，vasoinvasion(A)or tumor size(B)in cervical cancer patients. ±s. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs positive;△P ＜0.05 vs ≥4 cm.圖4 宮頸癌患者CD3 +CD8 －IL－21 +T 細胞比例與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管轉(zhuǎn)移及腫瘤大小的關系

2 CD3+CD8－IL－21+T 細胞在CIN 及宮頸癌患者外周血中的比例升高

與正常對照組［(4.54 ±2.22)%］相比，CD3+CD8－IL－21+T 細胞比例在CIN 患者組［(5.22 ±1.74)%，P ＜0.05］及宮頸癌患者組［(6.17 ±2.21)%，P ＜0.05］都明顯升高，而CIN 組與宮頸癌組之間無顯著差異(P ＞0.05)。在宮頸癌組，CD3+CD8－IL－21+T 細胞比例亦與臨床分期呈正相關(P＜0.05)，并且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組［(7.29 ±2.43)% vs (5.66 ±2.24)%，P ＜0.05］，脈管侵潤組高于無脈管侵潤組［(7.86 ±1.43)% vs(4.63 ±1.88)%，P ＜0.01］。CD3+CD8－IL－21+T細胞比例還與腫瘤大小相關，與腫瘤體積＜4 cm 組［(5.21 ±2.43)%］相比，腫瘤體積≥4 cm 組［(7.08±2.31)%，P ＜0.05］其比例明顯升高。CD3+CD8－IL－21+T 細胞比例與組織學類型、分化程度及浸潤深度無明顯相關(P ＞0.05)。

3 Th17 與CD3+CD8－IL－21+T 細胞的相關性

如圖5 所示Th17 細胞比例與CD3+CD8－IL－21+T 細胞比例在正常對照組(r =0.753，P ＜0.01)和宮頸癌組(r =0.760，P ＜0.01)呈顯著正相關，而在CIN 患者組則無相關性(r=0.410，P ＞0.05)。

Figure 5. The correlation between Th17 cells and CD3 +CD8 －IL－21 +T cells. Positive correlation between the percentages of Th17 and CD3 +CD8 －IL－21 +T cells were found in healthy controls (A:r=0.753，P ＜0.01)and cervical cancer patients (B:r=0.760，P ＜0.01). No significant correlation was found in CIN (cervical intraepithelial neoplasia)patients (r=0.410，P ＞0.05). Pearson correlation test was used.圖5 Th17 細胞與CD3 +CD8 －IL－21 +T 細胞的相關性分析

討 論

Th17 細胞的發(fā)現(xiàn)使我們對T 細胞介導的免疫應答有了重新的認識［11，12］。在分化與調(diào)節(jié)上，Th17 細胞與具有顯著免疫抑制效應的調(diào)節(jié)性T 細胞(regulatory T cells，Treg)反向調(diào)節(jié)，關系密切［4，13］。在功能上，Th17 細胞及其細胞因子介導炎癥反應，在感染、炎癥、自身免疫性疾病及移植物抗宿主病中發(fā)揮著重要作用。而炎癥與腫瘤之間具有緊密的聯(lián)系［14］。因此Th17 細胞與腫瘤的關系已成為目前腫瘤免疫研究的熱點。

最近研究發(fā)現(xiàn)Th17 細胞及其相關細胞因子可能與腫瘤相關，并參與介導炎癥相關性腫瘤的免疫發(fā)病機制。但對Th17 細胞在腫瘤免疫中的性質(zhì)、作用和調(diào)控機制仍不完全清楚［4，15］。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Th17 細胞在胃癌患者的外周血、引流淋巴結(jié)中的比例升高，并且升高的程度與臨床分期有關，認為Th17 可能促進了胃癌的病理發(fā)展［16］。Kryczek 等［7］也報道Th17 細胞比例在前列腺癌小鼠、上皮性卵巢癌患者的外周血中升高。我們的研究結(jié)果也顯示，與健康對照組相比，Th17 細胞比例在CIN 和宮頸癌患者的外周血中升高，差異顯著。同時研究發(fā)現(xiàn)，外周血中的Th17 細胞可能是腫瘤侵潤Th17 細胞的主要來源［17］，而腫瘤內(nèi)的Th17 細胞中超過95%者不表達CD62L 和CCR7(稱之為effector memory T Tem，不能進入二級淋巴組織)，表示這些細胞是組織的常駐細胞，不會進入淋巴管和外周血循環(huán)［18］。Bonnotte等［19］通過結(jié)腸腺癌大鼠模型發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤部位CCL20(CCR6 的受體，可誘導Th17 細胞遷徙［17，20］)表達上調(diào)，并對腫瘤的生長有促進作用。這些數(shù)據(jù)表明，外周的Th17 細胞或許是腫瘤浸潤Th17 細胞的重要來源，并與腫瘤的進展有關。我們的結(jié)果顯示，宮頸癌患者組的Th17 細胞比例隨著臨床分期的進展而逐步升高，而且與沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組或沒有脈管轉(zhuǎn)移組相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和脈管轉(zhuǎn)移組的Th17 細胞比例都分別增高，差異顯著。由于臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管轉(zhuǎn)移狀況是評價宮頸癌預后的最重要指標，這一結(jié)果就暗示著Th17 細胞在宮頸癌的進展和導致不良預后上扮演著促進的角色。類似的結(jié)果在胃癌的研究中也得以發(fā)現(xiàn)［16］。我們會進行長期隨訪，以驗證這一結(jié)論。

Th17 的一個重要的效應性細胞因子是IL－21。IL－21 是Th17 細胞分泌的特征性細胞因子之一，不但以自分泌的形式通過STAT3 途徑誘導Th0 細胞向Th17 細胞分化［9，21］，還能刺激CD4+Th0 細胞分泌IL－17［10］。由于IL－21 的最主要來源是Th17 細胞［4，20，22］，并且具有放大和維持Th17 細胞功能的作用［10］，因此我們同樣通過流式細胞分析術檢測了CD3+CD8－IL－21+T 淋巴細胞在宮頸癌、CIN 和正常人外周血中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，CD3+CD8－IL－21+T 細胞比例在CIN 患者和宮頸癌患者中升高，并隨著疾病的進展逐步升高，增高的程度與宮頸癌的臨床分期呈正相關。同樣類似于Th17細胞的是，CD3+CD8－IL－21+T 細胞比例在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，在脈管侵潤組中高于無脈管侵潤組，差異顯著。同時我們的結(jié)果也顯示Th17 細胞比例與CD3+CD8－IL－21+T 細胞比例呈正相關，這些數(shù)據(jù)從側(cè)面進一步支持了Th17 細胞在宮頸癌患者升高的結(jié)果。此外，研究發(fā)現(xiàn)IL－21還能誘導上皮細胞分泌MIP－3α(macrophage inflammatory protein，CCL20)［23］，并 在其 趨 化 因 子 受 體CCR6 的吸引下誘導Th17 細胞進行遷徙［17，20］。因此我們推測CD3+CD8－IL－21+T 細胞在Th17 細胞促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起了重要的輔助調(diào)節(jié)作用。但在生理狀態(tài)下，荷瘤機體自分泌IL－21 的能力或許受到了Th17 細胞的限制，分泌的IL－21 只能在局部起作用，并不能達到高水平以發(fā)揮抗腫瘤作用，因此，如何協(xié)調(diào)Th17 細胞與IL－21 的關系或許可以成為腫瘤治療的可行性策略。

綜上所述，IL－21 伴隨著Th17 細胞在CIN 和宮頸癌患者體內(nèi)表達增高，并隨著疾病進展逐步積聚，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。盡管IL－21具有抗腫瘤作用，但是由于其來源主要是Th17 細胞，并在Th17 細胞的分化和功能維持上起著重要作用，因此，重新認識兩者之間的關系和免疫調(diào)節(jié)機制，并加以合理利用，將會為宮頸癌的臨床治療開辟一條新的策略。

［1］ Nakamura T，Shima T，Saeki A，et al. Expression of indoleamine 2，3－dioxygenase and the recruitment of Foxp3－ expressing regulatory T cells in the development and progression of uterine cervical cancer［J］. Cancer Sci，2007，98(6):874－881.

［2］ 廖百花，馮亦軍，肖小敏. 兔宮頸固相轉(zhuǎn)染靶向HPV16 siRNA 抑制荷宮頸癌SCID 小鼠HPV 的復制［J］.中國病理生理雜志，2010，26(4):695－699.

［3］ Patel S，Chiplunkar S. Host immune responses to cervical cancer［J］. Curr Opin Obstet Gynecol，2009，21(1):54－59.

［4］ Korn T，Carrier Y，Gao W，et al. IL－17 and Th17 cells［J］. Annu Rev Immunol，2009，27:485－517.

［5］ Dong C. TH17 cells in development:an updated view of their molecular identity and genetic programming［J］. Nat Rev Immunol，2008，8(5):337－348.

［6］ Sfanos KS，Bruno TC，Maris CH，et al. Phenotypic analysis of prostate－infiltrating lymphocytes reveals TH17 and Treg skewing［J］. Clin Cancer Res，2008，14(11):3254－3261.

［7］ Kryczek I，Wei S，Zou L，et al. Cutting edge:Th17 and regulatory T cell dynamics and the regulation by IL－2 in the tumor microenvironment［J］. J Immunol，2007，178(11):6730－6733.

［8］ Miyahara Y，Odunsi K，Chen W，et al. Generation and regulation of human CD4+IL－17－producing T cells in ovarian cancer［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(40):15505－15510.

［9］ Nurieva R，Yang XO，Martinez G，et al. Essential autocrine regulation by IL－21 in the generation of inflammatory T cells［J］. Nature，2007，448(7152):480－483.

［10］ Wei L，Laurence A，Elias KM，et al. IL－21 is produced by Th17 cells and drives IL－17 production in a STAT3－dependent manner［J］. J Biol Chem，2007，282(48):34605－34610.

［11］ Bettelli E，Carrier Y，Gao W，et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells［J］. Nature，2006，441(7090):235－238.

［12］ Kryczek I，Banerjee M，Cheng P，et al. Phenotype，distribution，generation，and functional and clinical relevance of Th17 cells in the human tumor environments［J］.Blood，2009，114(6):1141－1149.

［13］ Mougiakakos D，Choudhury A，Lladser A，et al. Regulatory T cells in cancer［J］. Adv Cancer Res，2010，107:57－117.

［14］ Coussens LM，Werb Z. Inflammation and cancer［J］. Nature，2002，420(6917):860－867.

［15］ Tesmer LA，Lundy SK，Sarkar S，et al. Th17 cells in human disease［J］. Immunol Rev，2008，223(1):87－113.

［16］ Zhang B，Rong G，Wei H，et al. The prevalence of Th17 cells in patients with gastric cancer［J］. Biochem Biophys Res Commun，2008，374(3):533－537.

［17］ Zhang JP，Yan J，Xu J，et al. Increased intratumoral IL－17－producing cells correlate with poor survival in hepatocellular carcinoma patients［J］. J Hepatol，2009，50(5):980－989.

［18］ Bromley SK，Thomas SY，Luster AD. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics［J］. Nat Immunol，2005，6(9):895－901.

［19］ Bonnotte B，Crittenden M，Larmonier N，et al. MIP－3alpha transfection into a rodent tumor cell line increases intratumoral dendritic cell infiltration but enhances (facilitates)tumor growth and decreases immunogenicity［J］. J Immunol，2004，173(8):4929－4935.

［20］ Monteleone G，Pallone F，MacDonald TT. Interleukin－21:a critical regulator of the balance between effector and regulatory T－cell responses［J］. Trends Immunol，2008，29(6):290－294.

［21］ Spolski R，Leonard WJ. The Yin and Yang of interleukin－21 in allergy，autoimmunity and cancer［J］. Curr Opin Immunol，2008，20(3):295－301.

［22］ Ivanov II，McKenzie BS，Zhou L，et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL－17 + T helper cells［J］.Cell，2006，126(6):1121－1133.

［23］ Caruso R，F(xiàn)ina D，Peluso I，et al. A functional role for interleukin－21 in promoting the synthesis of the T－cell chemoattractant，MIP－3alpha，by gut epithelial cells［J］. Gastroenterology，2007，132(1):166－175.