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    遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響及其機(jī)制*

    2011-12-23 04:07:56戚仁斌汪志剛趙彥儒王華東陸大祥
    中國病理生理雜志 2011年6期
    關(guān)鍵詞:皂苷元遠(yuǎn)志存活率

    張 晶, 戚仁斌, 汪志剛, 趙彥儒, 王華東, 陸大祥

    (暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,暨南大學(xué)腦科學(xué)研究所,國家中藥管理局三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510632)

    材 料 和 方 法

    1 動(dòng)物與主要試劑

    1.1 動(dòng)物 新生24 h 內(nèi)SD 乳鼠,SPF 級(jí),由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)為SCXK 粵2006-0015。

    1.2 主要試劑 遠(yuǎn)志皂苷元,購于成都曼斯特生物科技有限公司,純度>98%。DMEM-F12 培養(yǎng)基、胎牛血清購于Hyclone。Neurobasal 培養(yǎng)基、B27 購于Gibco。四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、Hoechst 33258 購于Sigma。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。Trizol 購于Invitrogen。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega。SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒購于TaKaRa。3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體、Bcl-2、Bax 兔抗大鼠多克隆抗體來自CST。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 來自北京鼎國昌盛生物有限公司。

    1.3 主要儀器 微量核酸分光光度計(jì)(Thermo scientific),多功能全波長酶標(biāo)儀(Tecan),熒光顯微鏡(Olympus),梯度PCR 儀(PerkinElmer),lightcycler 480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Roche),Western blotting蛋白印跡電泳儀和蛋白印跡電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立 新生24 h 內(nèi)的SD 大鼠,無菌條件下斷頭取腦,分離海馬組織,置于終濃度為0.125%胰酶的PBS 中,快速剪成1 mm×1 mm×1 mm 左右組織塊,37 ℃消化10 min,用含10%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基終止消化,200 目篩網(wǎng)過濾,收集濾液,1 000 r/min 離心5 min,棄上清,重懸細(xì)胞,計(jì)數(shù)后以3.5 ×108/L 的密度種于培養(yǎng)板(多聚賴氨酸包被過夜)中,4 h 后全量換為含2%B27 的Neurobasal 培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)至第6 d,經(jīng)MAP2 鑒定神經(jīng)元純度后,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分正常組、H2O225 μmol/L、H2O250 μmol/L、H2O275 μmol/L、H2O2100 μmol/L 4 個(gè)濃度模型組,培養(yǎng)12 h 后,每孔加入0.5% MTT 溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄培養(yǎng)液,每孔加入DMSO 150 μL,充分溶解,酶標(biāo)儀570 nm 波長測定吸光度(absorbance,A)值,檢測細(xì)胞存活率。

    2.2 Sen 對(duì)H2O2損傷的海馬神經(jīng)元的影響

    ①Sen 對(duì)海馬神經(jīng)元存活率的影響 海馬神經(jīng)元接種于96 孔板中,實(shí)驗(yàn)分正常組及Sen 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L 5 個(gè)組,培養(yǎng)2 h 和12 h 后,MTT 法檢測細(xì)胞存活率,篩選對(duì)神經(jīng)元無損傷的藥物濃度。

    ②Sen 對(duì)氧化損傷海馬神經(jīng)元存活率的影響 96 孔板中分別加入20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L Sen,預(yù)培養(yǎng)12 h,然后加入終濃度為50 μmol/L 的H2O2,繼續(xù)培養(yǎng)12 h,MTT 法檢測細(xì)胞存活率。

    ③MDA、SOD 檢測 細(xì)胞分組同②,藥物干預(yù)神經(jīng)元后,裂解、收集細(xì)胞。取100 μL 收集液按照SOD和MDA 試劑盒說明書操作,測定吸光度值,并用BCA 法對(duì)細(xì)胞蛋白含量測定。

    2.3 Sen 對(duì)H2O2損傷的海馬神經(jīng)元的作用機(jī)制研究

    ①Sen 對(duì)H2O2損傷的海馬神經(jīng)元凋亡的影響 Hoechst 33258 是一種能夠穿透胞膜,結(jié)合DNA 的藍(lán)色熒光染料,常用于細(xì)胞凋亡的檢測。海馬神經(jīng)元經(jīng)藥物處理后,棄去培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定10 min,然后PBS 清洗2 次,加入Hoechst 33258 避光染色10 min,倒置顯微鏡下拍照。

    ②Real-time PCR 檢測bcl-2 和bax 基因表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為4 組,正常組、50 μmol/L H2O2組、Sen 20 μmol/L +H2O2組和Sen 20 μmol/L 藥物組。Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA,然后微量核酸分光光度計(jì)分析RNA 濃度和純度。按照Promega 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,取2 μg RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,逆轉(zhuǎn)總體系為25 μL。取逆轉(zhuǎn)產(chǎn)物cDNA 2 μL 進(jìn)行PCR 循環(huán)。設(shè)置反應(yīng)為95 ℃10 s,60 ℃10 s,72 ℃10 s,42 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完畢后數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT方法處理。根據(jù)GenBank 序列,采用分子生物學(xué)分析軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物,序列如下:bcl-2 上游引物5'-TGAACCGGCATCTGCACAC-3',下游引物5'-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3',產(chǎn)物長度116 bp。bax 上游引物5'-AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG-3',下游引物5'-GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3',產(chǎn)物長度197 bp。GAPDH 上游引物5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3',下游引物5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3',產(chǎn)物長度143 bp。

    ③Western blotting 檢測Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組同real-time PCR,棄板中培養(yǎng)液,每孔中加入60 μL 細(xì)胞裂解液裂解30 min,然后轉(zhuǎn)移到離心管中,4 ℃12 000 r/min 離心10 min,分裝上清,-80℃保存。蛋白經(jīng)BCA 法定量后,配制SDS 聚丙烯酰胺凝膠,上樣電泳,蛋白電轉(zhuǎn)移,抗體孵育,顯影。結(jié)果以目的條帶與GAPDH 條帶的灰度比值評(píng)定蛋白質(zhì)表達(dá)相對(duì)含量。

    ④Caspase-3 活性檢測 實(shí)驗(yàn)分組同real-time PCR,室溫下解凍100 ×酶作用物和緩沖稀釋液,渦旋振蕩器混勻酶作用物,用緩沖稀釋液將100 ×酶工作液稀釋至1 ×酶工作液,臨用前配好。按照培養(yǎng)液∶酶工作液=1∶1 比例向96 孔板中加入酶工作液,微量振蕩器振蕩30 s,25 ℃孵育60 min,酶標(biāo)儀檢測發(fā)光值。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。

    結(jié) 果

    1 模型建立

    細(xì)胞培養(yǎng)6 d 后,胞體呈梭形或三角形,突起增多、延伸,并且可見突起延伸形成的網(wǎng)絡(luò),經(jīng)MAP-2鑒定后,神經(jīng)元數(shù)目占細(xì)胞總數(shù)90%以上,可用于實(shí)驗(yàn)。25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L H2O2作用神經(jīng)元12 h 后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞損傷程度與H2O2濃度呈劑量相關(guān)性,MTT 結(jié)果顯示,細(xì)胞存活率分別為(95.6 ±11.6)%、(73.1 ±6.8)%、(61.5 ±5.6)%、(58.8±9.5)%,本實(shí)驗(yàn)選擇50 μmol/LH2O2作為細(xì)胞造模濃度,見圖1。

    Figure 1. Effect of different concentrations of H2O2 on cell viability in hippocampal neurons. ± s. n = 3. * P <0.05,**P <0.01 vs 0 μmol/L.圖1 H2O2 對(duì)海馬神經(jīng)元存活率的影響

    2 Sen 對(duì)海馬神經(jīng)元的影響

    2.1 Sen 對(duì)海馬神經(jīng)元存活率的影響 不同濃度Sen 與海馬神經(jīng)元共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),與正常組相比,培養(yǎng)2 h,Sen 對(duì)細(xì)胞存活率未見明顯影響,而培養(yǎng)12 h后,Sen 濃度為20 μmol/L 和40 μmol/L 時(shí),細(xì)胞存活率分別為(116.3 ±2.7)%和(109.0 ±2.9)%,差異顯著(P <0.05),見圖2。

    Figure 2. Effect of different concentrations of Sen on cell viability in hippocampal neurons at different time points. ±s.n=3. * P <0.05 vs 0 μmol/L.圖2 不同遠(yuǎn)志皂苷元濃度和時(shí)間對(duì)海馬神經(jīng)元存活率的影響

    2.2 Sen 對(duì)氧化損傷的海馬神經(jīng)元存活率的影響

    與正常組相比,H2O2組細(xì)胞存活率約為(76.8 ±9.8)%,差異顯著(P <0.05);與H2O2組相比,20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L Sen 藥物預(yù)處理后,細(xì)胞存活率升高,分別為(90.5 ± 8.9)%、(87.8 ±8.1)%、(86.6±7.5)%,差異顯著(P <0.05),見圖3。

    Figure 3. Effect of Sen on viability of hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n =3. * P <0.05 vs control(non-treatment);#P <0.05 vs H2O2 group.圖3 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的存活率影響

    2.3 Sen 對(duì)神經(jīng)元胞內(nèi)MDA 含量和SOD 活性的影響 與正常組相比,H2O2組細(xì)胞SOD 活性降低,MDA 含量升高,差異顯著(P <0.05);與H2O2組相比,20 μmol/L Sen 預(yù)處理組細(xì)胞,SOD 活性提高,MDA 含量降低,差異顯著(P <0.05);其它濃度組未見明顯區(qū)別,見表1。

    表1 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元內(nèi)SOD 活性和MDA 含量的影響Table 1. Effect of Sen on activity of SOD and content of MDA in hippocampal neurons treated with H2O2(±s.n=3)

    表1 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元內(nèi)SOD 活性和MDA 含量的影響Table 1. Effect of Sen on activity of SOD and content of MDA in hippocampal neurons treated with H2O2(±s.n=3)

    * P <0.05 vs control;#P <0.05 vs H2O2 group.

    Group SOD(103U/g protein) MDA(μmol/g protein)Control 26.72±2.08 1.48±0.09 H2O2 50 μmol/L 13.10±0.95* 2.70±0.26*H2O2+Sen 20 μmol/L 19.60±3.95# 1.99±0.15#H2O2+Sen 30 μmol/L 18.80±1.68 2.31±0.10 H2O2+Sen 40 μmol/L 18.61±2.04 2.38±0.16

    3 凋亡相關(guān)檢測結(jié)果

    3.1 Hoechst 33258 染色形態(tài)觀察 Hoechst 33258細(xì)胞核染色后拍照,圖4A 示正常組,細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻低強(qiáng)度熒光,見少量高亮濃染的凋亡形態(tài)細(xì)胞;圖4B 示H2O2組,見大量細(xì)胞核濃染、高亮固縮,凋亡特征的細(xì)胞多于正常組;圖4C 示20 μmol/L Sen +H2O2組,高亮藍(lán)染的凋亡形態(tài)細(xì)胞比H2O2組少;圖4D 示Sen 單獨(dú)處理細(xì)胞組,凋亡特征形態(tài)的細(xì)胞數(shù)與正常組相比,未見明顯差別。

    Figure 4. Morphological changes of nucleus of apoptotic hippocampal neurons shown by Hoechst 33258 staining. The apoptotic cells are indicated by arrows (×200).A:control group;B:H2O2 50 μmol/L group;C:H2O2 +Sen 20 μmol/L group;D:Sen 20 μmol/L group.圖4 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷形態(tài)的影響

    3.2 bcl-2 mRNA 表達(dá) Real-time PCR 結(jié)果顯示,與正常組相比,H2O2組抗凋亡基因bcl-2 表達(dá)下調(diào),差異顯著(P <0.05);與H2O2組相比,20 μmol/L Sen+H2O2組bcl-2 mRNA 表達(dá)升高,差異顯著(P <0.05);Sen 單獨(dú)處理組與正常組未見明顯差異,見圖5。

    Figure 5. Effect of Sen on the expression of bcl-2 mRNA in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s. n=4. #P <0.05 vs control (non-treatment)* P <0.05 vs H2O2 group.圖5 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元bcl-2 mRNA 表達(dá)的影響

    3.3 bax mRNA 表達(dá) Real-time PCR 結(jié)果顯示,與正常組相比,H2O2組bax表達(dá)下調(diào),差異顯著(P<0.05);與H2O2組相比,20 μmol/L Sen +H2O2組bax mRNA 表達(dá)升高,差異顯著(P <0.05);Sen 單獨(dú)處理組與正常組未見明顯差異,見圖6。

    Figure 6. Effect of Sen on the expression of bax mRNA in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n=3. #P <0.05 vs control(non-treatment);* P <0.05 vs H2O2 group.圖6 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元內(nèi)bax mRNA表達(dá)的影響

    3.4 Bcl-2 蛋白表達(dá) Western blotting 結(jié)果顯示,與正常組相比,H2O2組Bcl-2 蛋白表達(dá)下降,差異顯著(P <0.05);與H2O2組相比,20 μmol/L Sen +H2O2組Bcl-2 表達(dá)升高,差異顯著(P <0.05);與正常組相比,Sen 單獨(dú)處理組Bcl-2 表達(dá)升高,差異顯著(P <0.05),見圖7。

    3.5 Bax 蛋白表達(dá) Western blotting 結(jié)果顯示,與正常組相比,H2O2組Bax 蛋白表達(dá)上調(diào),差異顯著(P <0.05);與H2O2組相比,20 μmol/L Sen+H2O2組Bax 表達(dá)下降,差異顯著(P <0.05),見圖8。

    3.6 Sen 對(duì)caspase-3 活性的影響 與正常組相比,H2O2組caspase-3 活性升高,差異顯著(P <0.05);與H2O2組相比,20 μmol/L Sen+ H2O2組細(xì)胞caspase-3 活性降低,差異顯著(P <0.05),見圖9。

    Figure 7. Effect of Sen on the expression of Bcl-2 protein in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n=3. *P <0.05 vs control (non-treatment);#P <0.05 vs H2O2 group.圖7 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

    Figure 8. Effect of Sen on the expression of Bax protein in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s. n =3. * P<0. 05 vs control(non-treatment);#P <0. 05 vs H2O2 group.圖8 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元內(nèi)Bax 蛋白表達(dá)的影響

    Figure 9. Effect of Sen on the activity of caspase-3 in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n =3. #P <0.05 vs control(non-treatment);* P <0.05 vs H2O2 group.圖9 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元caspase-3 活性的影響

    討 論

    近年來研究表明,ROS 引起的氧化應(yīng)激與神經(jīng)退行性疾病有密切聯(lián)系,這與神經(jīng)元需氧和耗氧高于機(jī)體內(nèi)其它類型細(xì)胞有關(guān),因此,神經(jīng)元受到ROS攻擊時(shí),更容易產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。Ma 等[7]發(fā)現(xiàn)提高線粒體內(nèi)SOD 活性,可以改善由于氧化應(yīng)激引起的AD 模型小鼠Tg2576 小鼠記憶障礙;在快速老化小鼠SAMP10 的海馬研究中發(fā)現(xiàn),其神經(jīng)元線粒體SOD 活性明顯低于正常小鼠,而MDA 含量則高于正常小鼠(P <0.01),說明其在其海馬組織中的自由基含量有所增高,亦提示氧化應(yīng)激損傷可能是AD 發(fā)生的重要因素之一[8]。Whittemore 等[9]通過H2O2誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特異DNA 染色以及DNA ladder 檢測,發(fā)現(xiàn)H2O2可能介導(dǎo)了Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡;Hensley 等[10]運(yùn)用水楊酸羥化法也證實(shí)在無細(xì)胞的Aβ(25-35)培養(yǎng)液中能夠產(chǎn)生活性氧,而且氧化作用敏感的酶失活,如谷氨酰胺合成酶。此外,還有研究表明Aβ 可以通過ROS 氧化作用加重對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷,增強(qiáng)細(xì)胞因子引起的炎癥反應(yīng)[1]。因此,氧化應(yīng)激是AD 發(fā)病中的重要因素之一,也基于這個(gè)原因,從氧化應(yīng)激多個(gè)環(huán)節(jié)來研究AD 發(fā)病機(jī)制和防治措施逐漸成為共識(shí)。

    本室先前自擬中藥Q0409 組方[4]和抗衰益智方Ⅰ[5](主要成分為遠(yuǎn)志)可以改善SAMP-8 小鼠、東莨菪堿所致記憶障礙小鼠和自然衰老記憶障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,并且能提高正常小鼠腦內(nèi)乙酰膽堿含量,從而提高正常小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。為了進(jìn)一步探討Q0409 組方和抗衰益智方Ⅰ抗AD 機(jī)制,我們?cè)诖搜芯炕A(chǔ)上,選擇上述組方的主要單體成分之一遠(yuǎn)志皂苷元進(jìn)行深入研究。已有的研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志皂苷元具有一定的抗氧化損傷的作用,如田楓等[11]研究遠(yuǎn)志皂苷元能顯著提高快速老化癡呆模型小鼠SAMP/8 腦組織總蛋白含量、總抗氧化能力和促進(jìn)蛋白質(zhì)和核酸的合成,孫桂波等[12]觀察遠(yuǎn)志皂苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的作用,結(jié)果顯示其能夠明顯改善細(xì)胞存活率,LDH 漏出量、MDA 含量降低,SOD 活性升高(P <0.01)。

    本研究采用H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)元氧化損傷模型,觀察遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)其作用并探討機(jī)制,實(shí)驗(yàn)證實(shí),50 μmol/L H2O2作用于海馬神經(jīng)元12 h 即可造成細(xì)胞氧化損傷,神經(jīng)元存活率下降,SOD 活性降低,MDA 含量升高,而細(xì)胞經(jīng)過Sen 預(yù)處理后,Sen 劑量與神經(jīng)元存活率具有量效關(guān)系,20 μmol/L Sen 處理后抗氧化能力增強(qiáng)顯著,這與文獻(xiàn)報(bào)道皂苷物質(zhì)對(duì)氧自由基本身影響較少,而大部分可能提高體內(nèi)SOD 等抗氧化酶活性,從而減輕氧自由基對(duì)機(jī)體損傷[13]相一致。低濃度H2O2作用于細(xì)胞時(shí),可通過影響凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與相關(guān)基因功能,造成細(xì)胞凋亡,其中Bcl-2 家族和caspase-3 家族在H2O2誘導(dǎo)的凋亡過程中起重要作用[14-16]。我們通過Hoechst 33258 染色發(fā)現(xiàn),經(jīng)H2O2作用后細(xì)胞核呈凋亡特征性改變,而20 μmol/L Sen 預(yù)處理組較H2O2組凋亡細(xì)胞減少,進(jìn)一步觀察Bcl-2 家族蛋白及caspase-3 表達(dá),結(jié)果證實(shí),與正常組相比,H2O2組Bcl-2 蛋白表達(dá)下調(diào),Bax 蛋白表達(dá)上調(diào),caspase-3 活性升高,而20 μmol/L Sen+ H2O2組,Bcl-2 蛋白表達(dá)增加,Bax 蛋白表達(dá)下降,caspase-3 活性降低,提示Sen 可能通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白從而抑制細(xì)胞凋亡。

    綜上所述,遠(yuǎn)志皂苷元可以通過提高海馬神經(jīng)元抗氧化酶的活性,抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示遠(yuǎn)志皂苷元具有防治AD 的應(yīng)用前景,該作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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