番薯過(guò)氧化物酶的分離純化及其性質(zhì)研究

李 霞，韓 鳳，何 睿，焦艷華，梁媛媛，陳燦玉，謝 恬

（杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江杭州 310012）

番薯過(guò)氧化物酶的分離純化及其性質(zhì)研究

李 霞，韓 鳳，何 睿，焦艷華，梁媛媛，陳燦玉，謝 恬

（杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江杭州 310012）

從番薯皮中分離和純化番薯過(guò)氧化物酶，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征，分析了溫度、pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響，考查了酶的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性.分離純化過(guò)程包括勻漿、水提、雙水相萃取、Sepharose CL-6B凝膠層析、Phenyl Sepharose 6fast flow疏水層析、Con A Sepharose 4B親和層析.經(jīng)純化的番薯過(guò)氧化物酶比活力為6 930U／mg，SDS-PAGE顯示一條帶，分子量為34 000，RZ值為2.酶反應(yīng)的最適pH在5.5附近，最適溫度為70℃；在中性偏堿性條件下酶的穩(wěn)定性非常高，60℃保溫1h，酶活力殘余60%.結(jié)果表明番薯過(guò)氧化物酶是一種良好的耐酸堿、耐熱過(guò)氧化物酶.

番薯；過(guò)氧化物酶；純化與性質(zhì)

過(guò)氧化物酶是一類(lèi)可催化由過(guò)氧化氫參與的氧化各種還原劑的氧化酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，可應(yīng)用于酶免疫測(cè)定、藥物診斷、生物傳感器、有機(jī)合成、水污染治理等［1］.辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）最早被作為標(biāo)記酶，廣泛應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析（chemiluminescent enzyme immunoassay，CL-ELISA）中.但HRP在催化Luminol-H2O2發(fā)光體系中，與發(fā)光底物反應(yīng)不穩(wěn)定，信號(hào)衰減迅速，需添加增強(qiáng)劑加強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度才能滿足檢測(cè)要求，并且高溫條件下不穩(wěn)定.近年來(lái)相繼發(fā)現(xiàn)一些植物過(guò)氧化物酶，如Arthromycesramonusperoxidase（ARP）［2］、palm tree leaves peroxidase（PTP）［3］和soya beans peroxidase（SbP）［4－5］，不需要增強(qiáng)劑即可催化魯米諾發(fā)光底物發(fā)光，且發(fā)光靈敏度高，發(fā)光時(shí)效長(zhǎng).其中SbP是繼HRP后研究最為深入的，國(guó)外已有公司將其用于醫(yī)藥診斷試劑盒的生產(chǎn).2007年，Alpeeva和Sakharov［6］發(fā)現(xiàn)番薯過(guò)氧化物酶（sweet potato peroxidase，SPP）催化魯米諾發(fā)光具有更高的靈敏度，且發(fā)光時(shí)間長(zhǎng)，穩(wěn)定性高.該文主要報(bào)道了從本地番薯皮中純化過(guò)氧化物酶的方法及其酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果，為番薯過(guò)氧化物酶的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

浙江杭州本地產(chǎn)番薯（IpomoeabatatasLam.）.

1.2 試 劑

Sepharose CL-6B（GE），Phenyl Sepharose 6fast flow（GE），Con A Sepharose 4B（GE），α－甲基-D-甘露糖苷（阿拉?。?，PEG 6000Japan分裝，北京鼎國(guó)），愈創(chuàng)木酚（BBI30%過(guò)氧化氫（杭州高晶精細(xì)化工有限公司），考馬斯亮藍(lán)-R250（USB）.其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.3 儀 器

AKAT層析系統(tǒng)，北京六一DYY-6C型電泳儀器，德國(guó)CHRIST ALPHR 1-2LD BPLUS凍干機(jī)，UNICO 2800UV∕VIS分光光度計(jì)，美國(guó)GE ImageQuant 300凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Beckman高速冷凍離心機(jī)，Allegra X-22R離心機(jī).

1.4 純化方法

1.4.1 雙水相萃取

取新鮮番薯皮（1kg），組織搗碎，加入4倍體積的水浸提，過(guò)濾，殘?jiān)貜?fù)提取兩次，合并濾液，5 000r／min離心30min.收集上清，攪拌條件下緩慢加入PEG 6000和（NH4）2SO4，使兩者最終質(zhì)量濃度分別達(dá)到60mg／mL和300mg／mL，約1h內(nèi)加完，置入分液漏斗中靜置分層.收集下相液體，透析除鹽，凍干，保存.

1.4.2 凝膠層析Sepharose CL-6B（2.6cm×60cm）

流速0.5mL／min，蒸餾水洗脫.測(cè)定酶活，收集有酶活的部分，凍干.

1.4.3 疏水層析Phenyl Sepharose 6fast flow（1.6cm×30cm）

流速1mL／min，依次用1.0，0.5，0mol／L（NH4）2SO4溶液洗脫.測(cè)定酶活，收集有酶活的部分，透析除鹽，凍干.

1.4.4 親和層析Con A Sepharose 4B（1.6cm×20cm）

流速1mL／min，親和柱首先用pH為7.4的Tris-HCl緩沖液（含1mmol／L MnCl2、1mmol／L CaCl2、0.15mol／L NaCl）平衡.將預(yù)分離組分經(jīng)上述結(jié)合緩沖液溶解后上樣吸附.用pH為7.4的Tris-HCl緩沖液（含1mmol／L MnCl2、1mmol／L CaCl2）洗去未結(jié)合部分，最后用pH為7.4的Tris-HCl緩沖液（含0.2mol／Lα－甲基-D-甘露糖苷、0.15mol／L NaCl）洗脫.測(cè)定酶活，合并有酶活的部分，透析除鹽，凍干，保存.

1.5 分析方法

1.5.1 酶純度和蛋白含量測(cè)定

以RZ值表示酶的純度.RZ＝A403∕A275，403nm處是血紅素輔基的吸收峰，275nm處是蛋白質(zhì)的吸收峰.以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，考馬斯亮藍(lán)染色法［7］測(cè)定蛋白含量.

1.5.2 酶活測(cè)定

愈創(chuàng)木酚法檢測(cè)，2.0mL的磷酸鹽緩沖液（0.05mol／L，pH為6.0，含45mmol／L愈創(chuàng)木酚和5mmol／L過(guò)氧化氫），50μL酶液，25℃下檢測(cè)470nm處的吸光度變化（ΔA470／min）.以25℃下每分鐘轉(zhuǎn)化1μmol底物定義為一個(gè)酶活單位.

1.5.3 SDS-PAGE電泳

按文獻(xiàn)［8］進(jìn)行，采用12%分離膠，5%的濃縮膠，考馬斯亮藍(lán)染色.

1.6 酶的理化性質(zhì)測(cè)定

1.6.1 pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響

以不同pH的檸檬酸－磷酸鹽緩沖液配制底物，于25℃測(cè)定不同pH時(shí)反應(yīng)初始的ΔA470／min.實(shí)驗(yàn)pH設(shè)定為2.2，3，4，5，6，7和8.

1.6.2 溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響

分別把90mmol／L愈創(chuàng)木酚溶液和10mmol／L H2O2溶液于測(cè)試溫度進(jìn)行保溫，測(cè)試時(shí)各取2mL等體積混合，立刻加待測(cè)酶液50μL，測(cè)定反應(yīng)初始的ΔA470／min.實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)定為15，30，45，60，75和90℃.

1.6.3 熱穩(wěn)定性

酶液分別在40，60，70和80℃水浴1h后立即冷卻至25℃檢測(cè)酶活，以4℃保存1h后的酶活為100%對(duì)照求相對(duì)酶活.

1.6.4 酸堿穩(wěn)定性

酶液分別保存在pH為2.2，4，6，7.4和8的檸檬酸－磷酸鹽緩沖液和pH為10的甘氨酸－氫氧化鈉緩沖液中，4℃保存24h后檢測(cè)酶活.以4℃保存在pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中的酶液為對(duì)照計(jì)算相對(duì)酶活.

2 結(jié)果與討論

2.1 番薯過(guò)氧化物酶的純化和純度鑒定

番薯皮經(jīng)勻漿、水提后采用PEG 6000—（NH4）2SO4雙水相體系進(jìn)行萃取，溶液分為上下兩相：上相為深褐色油狀液體，主要為PEG 6000和色素等物質(zhì)；下相為淺色液體，主要成分為（NH4）2SO4和蛋白.經(jīng)過(guò)雙水相萃取后色素等雜質(zhì)大部分除去.雙水相萃取后，進(jìn)行Sepharose CL-6B凝膠層析（圖1），出現(xiàn)兩個(gè)洗脫峰，活性蛋白集中在第二個(gè)峰中.收集該酶活組分，進(jìn)行Phenyl Sepharose 6fast flow疏水層析（圖2），活性部分集中在第二個(gè)峰，為0.5mol／L（NH4）2SO4溶液洗脫峰.收集該酶活組分，進(jìn)行Con A Sepharose 4B親和層析（圖3），活性部分為第三個(gè)峰，經(jīng)純化后酶的比活提高165倍，活力回收為17%，RZ值為2（表1）.純化的過(guò)氧化物酶經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，顯示一條蛋白帶，分子量為34kDa（圖4）.

表1 番薯過(guò)氧化物酶的純化Tab.1 Purification of sweet potato peroxidase

2.2 酶的理化性質(zhì)

2.2.1 pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響

圖5結(jié)果表明，番薯過(guò)氧化物酶的pH作用范圍很寬，以愈創(chuàng)木酚為底物最適pH在5.5附近.

2.2.2 溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響

如圖6所示，溫度在30～60℃之間番薯過(guò)氧化物酶的活性幾乎呈直線上升，在70℃左右達(dá)到最高，然后迅速下降.實(shí)驗(yàn)表明，番薯過(guò)氧化物酶在高溫下有很好的活性，反應(yīng)最適溫度在70℃附近.

2.2.3 熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性

如圖7所示，番薯過(guò)氧化物酶的熱穩(wěn)定性相當(dāng)高，60℃保存1h后仍有60%的酶活剩余.圖8所示番薯過(guò)氧化物酶的酸堿穩(wěn)定性比較好，在pH為2處保存24h酶仍有活性，在中性偏堿的條件下穩(wěn)定性更高.

2.3 討 論

該文介紹了從番薯皮中分離純化過(guò)氧化物酶的方法，得到一種性質(zhì)優(yōu)良的番薯過(guò)氧化物酶.以愈創(chuàng)木酚作為底物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明番薯過(guò)氧化物酶有很寬的pH作用范圍和很廣的溫度適用范圍，在70℃下仍有很好的活性.過(guò)氧化物酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、環(huán)保和化工等行業(yè)中，酶的理化性質(zhì)，如最適pH、最適溫度以及熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，在其應(yīng)用中很重要.不同來(lái)源的過(guò)氧化物酶理化性質(zhì)不一樣［9］，目前商品化的HRP酸堿耐受性較差，且熱穩(wěn)定性也不高［5］.與HRP相比，番薯過(guò)氧化物酶是一種良好的耐酸堿、耐熱的過(guò)氧化物酶，可以彌補(bǔ)HRP的不足，能夠替代HRP應(yīng)用在更廣的領(lǐng)域內(nèi).

純化過(guò)程中采用的雙水相萃取技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展并應(yīng)用于生物大分子制備的新技術(shù)，其代替經(jīng)典鹽析法純化過(guò)氧化物酶具有實(shí)驗(yàn)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、收率高、易于大量純化蛋白等優(yōu)點(diǎn)［10］.植物中富含色素，在雙水相萃取后色素集中在上相的有機(jī)相中，過(guò)氧化物酶主要集中濃縮在下相的鹽溶液中，由此可以有效地去除粗酶中的色素雜質(zhì).

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Purification and Characterization of Sweet Potato Peroxidase

LI Xia，HAN Feng，HE Rui，JIAO Yan-hua，LIANG Yuan-yuan，CHEN Can-yu，XIE Tian

（Research Center of Biomedicine and Health，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310012，China）

The experiment purified and characterized the sweet potato peroxidase from sweet potato peel ofIpomoea batatas.The extraction and purification procedure included homogenate，water extraction，aqueous two-phase extraction，Sepharose CL-6Bgel filtration，Phenyl Sepharose 6fast flow hydrophobic chromatography and Con A Sepharose 4Baffinity chromatography.The specific activity of purified peroxidase was 6 930U／mg.The molecular weigh of sweet potato peroxidase was estimated to be 34 000by SDS-PAGE as a single band，and its RZ value was about 2.0.The optimum activity and optimum temperature for enzyme reactron was at pH 5.5and 70℃respectively.The enzyme was stable in pH 2.2～10.At 60℃，it took 1hto inactivate 60%of the enzyme.The results show that sweet potato peroxidase is very stable at high temperature and extreme pH.

Ipomoeabatatas；peroxidase；purification and characterization

Q554＋.6

A

1674-232X（2011）03-0253-05

10.3969／j.issn.1674-232X.2011.03.013

2011-01-13

浙江省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009B124）.

李 霞（1981—），女，黑龍江肇東人，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物的分離研究.E-mail：lix754＠yahoo.cn