牛角蘚Cratoneuronfilicinum（Hedw.）Spruce的RAPD分類研究

李鵬勃，吳玉環(huán)，＊，羅 昊

（1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310036；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧沈陽 110016）

牛角蘚Cratoneuronfilicinum（Hedw.）Spruce的RAPD分類研究

李鵬勃1，吳玉環(huán)1，2＊，羅 昊2

（1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310036；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧沈陽 110016）

以采自四川、甘肅、湖南等8省的9份牛角蘚標(biāo)本為材料，運(yùn)用RAPD技術(shù)對牛角蘚的分類修訂進(jìn)行研究.利用15條隨機(jī)引物共獲得134條清晰譜帶，其中多態(tài)性條帶占91.79%，牛角蘚各標(biāo)本間的遺傳相似系數(shù)為0.703～0.870.結(jié)果顯示：雖然9份牛角蘚標(biāo)本的形態(tài)特征差異非常大，但通過RAPD分析表明其為同一種.

牛角蘚；RAPD；分類修訂；環(huán)境飾變

牛角蘚屬（Cratoneuron（Sull.）Spruce）是薄羅蘚亞目（Leskeineae）柳葉蘚科（Amblystegiaceae）的一個屬，現(xiàn)記錄僅有1種1變種［1］，即牛角蘚（Cratoneuronfilicinum（Hedw.）Spruce）和牛角蘚寬肋變種（Cratoneuronfilicinum（Hedw.）Spruce var.atrovirens（Brid.）Ochyra），廣泛分布于日本、俄羅斯，東南亞、歐洲、北美和北非等地，我國東北、秦嶺沿線、西南地區(qū)及新疆等地也有較為豐富的資源［2］.

牛角蘚植物體大小、葉形和角部細(xì)胞等形態(tài)特征變異非常大，且表現(xiàn)出明顯的依生態(tài)環(huán)境（尤其是固著基質(zhì)和水濕條件）不同而相異的特點(diǎn)［3］，因此對經(jīng)典形態(tài)分類學(xué)結(jié)果造成了較大的影響，以致以前的學(xué)者們根據(jù)是否具鱗毛、中肋的粗細(xì)、葉形和角部細(xì)胞的不同變化等將大量牛角蘚標(biāo)本作為新種發(fā)表，其中以中國牛角蘚植物標(biāo)本發(fā)表的新種就有17個［4－6］.而Ochyra［1］則認(rèn)為全世界牛角蘚屬僅存牛角蘚及其寬肋變種，吳玉環(huán)等［7］對200余份牛角蘚標(biāo)本的葉形、中肋和角部細(xì)胞等特征數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析也得到了相似的結(jié)果.因此，急需尋求一種新的、更加穩(wěn)定可靠的研究方法來確定這些葉形和中肋等形態(tài)特征變化較大的牛角蘚是否可以簡單地歸于一種.

RAPD技術(shù)因其簡單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，加之在苔蘚植物研究中應(yīng)用時，能夠避免自身不能區(qū)分純合和雜合等劣勢［8］，近年來已在苔蘚植物遺傳多樣性檢測、遺傳關(guān)系討論、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位與分離等方面得到了廣泛的應(yīng)用［9－11］.

該文擬通過分子生物學(xué)手段對采自四川、甘肅、湖南等8個省份9個居群的牛角蘚進(jìn)行RAPD分類研究，探討中國牛角蘚不同居群的遺傳變異程度，并結(jié)合近年來經(jīng)典形態(tài)分類學(xué)所取得的研究成果，提出關(guān)于中國牛角蘚分類的新觀點(diǎn)，從期能為經(jīng)典形態(tài)分類學(xué)的研究成果提供新的分子實(shí)驗(yàn)證據(jù)，并為其他科屬苔蘚植物的系統(tǒng)分類修訂提供新的借鑒和參考.

1 材料與方法

1.1 材 料

9份采于不同地區(qū)及不同生態(tài)環(huán)境的牛角蘚標(biāo)本（表1），選取牛角蘚寬肋變種和柳葉蘚（Amblystegiumserpens）作為外類群.所用標(biāo)本均由沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所標(biāo)本館（IFSBH）提供.

表1 試驗(yàn)用標(biāo)本及其形態(tài)特征與采集地生態(tài)環(huán)境Tab.1 Specimens and their morphological characteristics and enviroments

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提?。▍⒖紡埖肋h(yuǎn)等［12］，稍作改動）

苔蘚植物DNA提取過程中經(jīng)常受到多酚和蛋白等物質(zhì)的影響，難度較大.該研究中DNA的提取采用改良CTAB法，在研磨后加入含有PVP，Vc等抗氧化劑和穩(wěn)定劑的緩沖液，能很好地抑制多酚氧化酶和細(xì)胞色素氧化酶的活性；抽提方法上，兩次使用氯仿抽提，能有效地去除蛋白質(zhì)等的影響.

將試驗(yàn)材料分別用70%酒精和蒸餾水清洗后放入研缽中，加入液氮迅速、充分研磨，待成極細(xì)粉末狀時迅速轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入800μL冰浴預(yù)冷的DNA研磨緩沖液，充分混勻后2 000r／min 4℃離心10min，棄上清，在沉淀中加入600μL經(jīng)65℃預(yù)熱的裂解緩沖液，緩慢混勻，65℃水浴60min（中間不時輕輕攪動）后加入等體積氯仿，搖勻后6 000r／min 4℃離心10min.然后取上清液于1.5mL離心管中，再加入等體積氯仿，搖勻后6 000r／min 4℃離心10min.取上清液，加入1／5體積10mol／L NH4Ac和等體積預(yù)冷異丙醇，混勻后－20℃靜止1h以上或過夜.12 000r／min 4℃離心10min沉淀DNA，再用70%乙醇洗滌沉淀數(shù)次，65℃干燥數(shù)分鐘，將沉淀溶于30μL的TE中，－20℃保存.

DNA研磨緩沖液配方：0.1mol／L Tris-HCL，pH為8.0；5mmol／L Na2EDTA，pH為8.0；20mg／mL PVP；25mg／mLβ－巰基乙醇；1mg／mL Vc.

裂解緩沖液配方：20mg／mL CTAB；0.1mol／L Tris-HCl，pH為8.0；20mmol／L Na2EDTA，pH為8.0；1.4mol／L NaCl；20mg／mL PVP；25mg／mLβ－巰基乙醇；1mg／mL Vc.

1.2.2 RAPD擴(kuò)增

反應(yīng)體系主要成分為：10×PCR buffer 2.5μL（10mmol／L Tris-HCl，pH為8.3；50mmol／L KCl），模板DNA 100ng，dNTP 0.1mmol／L，Taq polymerase 0.75U，引物0.20μmol／L，Mg2＋濃度2.00 mmol／L.反應(yīng)體系總體積為25μL.RAPD反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；變性94℃1min，退火36.5℃1min延伸72℃1min35個循環(huán)；延伸72℃10min.冷卻至4℃保存?zhèn)溆?

1.3 數(shù)據(jù)處理

PCR擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)1次，選取可重復(fù)的DNA帶（包括強(qiáng)帶和弱帶）記錄.每個樣品的擴(kuò)增帶按“有”或“無”記錄.“有”賦值為1，“無”賦值為0.根據(jù)Nei等［13］的方法計算樣品間的簡單遺傳相似系數(shù)I，計算公式為I＝2Nij／（Ni＋Nj），其中，（Ni＋Nj）為兩樣品的總擴(kuò)增帶數(shù)，Nij為兩樣品共有的擴(kuò)增帶數(shù).利用MVSP程序，按非加權(quán)算術(shù)平均數(shù)聚類方法（UPGMA）計算種間遺傳距離，建立系統(tǒng)聚類分析樹狀圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多態(tài)性

對60個引物進(jìn)行篩選，得到30個多態(tài)性引物，從中挑選出15個條帶清晰的引物進(jìn)行統(tǒng)計分析（表2）.這15個引物的G＋C占64.4%，共擴(kuò)增得到134條清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增帶，其中123條為多態(tài)性條帶，多態(tài)條帶比率（PPB）為91.79%，平均每個引物擴(kuò)增出8.9條多態(tài)性帶.片段大小在230～2 800bp之間，每個引物擴(kuò)增6至14條不等，表明這些物種RAPD變異性較大，多態(tài)性高（圖1）.

表2 RAPD分析用的15個隨機(jī)引物序列Tab.2 Sequences of 15primers used by analysis of RAPD

2.2 遺傳相似性

基于RAPD數(shù)據(jù)求得材料的遺傳相似系數(shù)（GS），結(jié)果如表3所示.11份樣品種內(nèi)或種間兩兩之間的GS值在0.315～0.870之間，平均為0.714.供試材料的種內(nèi)遺傳相似系數(shù)較高，種間遺傳相似系數(shù)較低：9份牛角蘚樣品兩兩之間的GS在0.703～0.870之間；而牛角蘚寬肋變種與9份牛角蘚樣品的GS為0.617～0.683；柳葉蘚與9份牛角蘚樣品的GS最低，在0.315～0.419之間.

2.3 牛角蘚的聚類分析

供試材料的聚類分析結(jié)果見圖2.從圖中可以看出，11份樣品可劃分為3個類群：第一類群為柳葉蘚；第二類群為牛角蘚寬肋變種；第三類群為9份牛角蘚樣品.在不同的引物中，9份牛角蘚樣品都存在特有帶，說明它們在基因組DNA的組成上具有共同序列.而這些帶在牛角蘚寬肋變種和柳葉蘚中并不存在，說明這些條帶是種的特征帶，由此表明9份樣品屬同一種.此外，UPGMA聚類圖顯示9份牛角蘚標(biāo)本中產(chǎn)于北溫帶附近的6個聚在一起，而產(chǎn)于高緯度的2個牛角蘚樣品聚在一起.

圖1 隨機(jī)引物OPC-11擴(kuò)增產(chǎn)生的RAPD帶型Fig.1 RAPD patterns generated with random primers OPC-11

表3 基于RAPD數(shù)據(jù)計算的11份標(biāo)本間的遺傳相似系數(shù)Tab.3 Genetic similarity of 11specimens based on RAPD analysis

3 討 論

該研究在分析每一個引物對試驗(yàn)樣品擴(kuò)增結(jié)果的基礎(chǔ)上，將大量的DNA條帶顯示結(jié)果數(shù)字化，編入二進(jìn)制輸入計算機(jī)，得出每一樣品的遺傳相似性系數(shù)，以種內(nèi)個體間相似系數(shù)的平均值為基礎(chǔ)，得出種間聚類圖.結(jié)果表明牛角蘚遺傳多樣性較高，且表現(xiàn)為地域較近的樣品首先聚合到一起，說明影響牛角蘚遺傳多樣性的因素與所處地域的遠(yuǎn)近有關(guān).牛角蘚多生于水源處，基因流的轉(zhuǎn)移有可能隨著水流的變化而變化.從聚類圖可以看出牛角蘚與其變種的相似性較大而與柳葉蘚較小，這是因?yàn)榕＝翘\與牛角蘚寬肋變種為同屬，親緣關(guān)系較近，而與柳葉蘚關(guān)系較遠(yuǎn).

牛角蘚為世界廣布種，生于各種環(huán)境中，植物體大小和形態(tài)變化較大，尤其是葉片和細(xì)胞特征變化較大.對不同生態(tài)條件下采集的牛角蘚標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)特征觀察，其葉片三角形或披針形，中肋或達(dá)于葉尖、或終于葉尖前部、或突出葉尖，葉片中部細(xì)胞從六邊形到長菱形均有，表現(xiàn)出明顯依生態(tài)環(huán)境尤其是固著基質(zhì)和水濕條件不同而相異的特點(diǎn).這些多變的生態(tài)型給系統(tǒng)分類帶來許多爭議.有研究［14］表明，苔鮮植物普遍存在著可塑性，其可塑性甚至比大多數(shù)有花植物還要強(qiáng).這是因?yàn)樵谔︴r植物中，選擇作用有利于可塑性的產(chǎn)生，苔鮮植物有限的異體受精和基因交流能力限制了以產(chǎn)生新基因型的辦法來提高對環(huán)境的適應(yīng)能力［15］.因此不應(yīng)把形態(tài)特征上有明顯變異的牛角蘚簡單地成立為新種，這些變異可能是環(huán)境飾變的結(jié)果.該研究中，雖然不同生長環(huán)境條件下的牛角蘚植物體及其形態(tài)特征變化很大，但依據(jù)RAPD分析結(jié)果，9份牛角蘚樣品聚在一起，明顯與外類群牛角蘚寬肋變種和柳葉蘚分離，充分說明其為同一物種.該結(jié)果為經(jīng)典形態(tài)分類學(xué)的觀點(diǎn)提供了新的分子證據(jù).

圖2 基于RAPD數(shù)據(jù)用UPGMA法構(gòu)建的樹系圖Fig.2 Dendrogram using UPGMA based on RAPD data

［1］Ochyra R.Animadversions on the moss genusCratoneuron（Sull.）Spruce［J］.Journal of Hattori Botanical Laboratory，1989，67：203-242.

［2］Wu Yuhuan，Gao Chien，Li Wei.Amblystegiaceae［M］／／Hu Renliang，Wang Youfang，Crosby M R.Moss Flora of China：Vol 7.Beijing：Science Press，2009：32-35.

［3］吳玉環(huán)，高謙，曹同.柳葉蘚科［M］／／胡人亮，王幼芳.中國苔蘚志：卷7.北京：科學(xué)出版社，2005：6-12.

［4］Redfearn P L，Tan B C，He S.A newly updated and annotated checklist of Chinese mosses［J］.Journal of Hattori Botanical Laboratory，1996，79：163-357.

［5］白學(xué)良，趙尊田.內(nèi)蒙古苔蘚志［M］.呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)出版社.1997：384-419.

［6］Wijk R，Margardant W D，F(xiàn)lorschutz P A.Index Muscorum：Volume 1［M］.Utrecht：International bureau for plant taxonomy and nomenclature of the international association for plant taxonmy，1959：1-548.

［7］吳玉環(huán)，羅昊，李微，等.牛角蘚（Cratoneuronfilicinum（Hedw.）Spruce）葉片形態(tài)特征的生態(tài)變異及其分類學(xué)意義［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2007，26（6）：882-885.

［8］劉麗，朱永青，王幼芳.鼠尾蘚不同居群間形態(tài)及RAPD分析［J］.云南植物研究，2006，28（6）：570-574.

［9］Sten?ien H K，S?stad S M.Genetic structure in three haploid peat mosses（Sphagnum）［J］.Heredity，1999，82：391-400.

［10］Skotnicki M L，Selkirk P M，Broady P，etal.Dispersal of the mossCampylopuspyriformison geothermal ground near the summits of Mount Erebus and Mount Melbourne，Victoria Land，Antarctica［J］.Antarctic Science，2001，13（3）：280-285.

［11］Zhu Yongqing，Liu Li，Wang Youfang，etal.Genetic diversity and population structure ofBrachytheciumrivulareSchimp.（Brachytheciaceae）from Foping Nature Reserve，Shaanxi，China，detected by RAPD markers［J］.Journal of Bryology，2007，29（2）：104-110.

［12］張道遠(yuǎn)，張?jiān)?，曹?耐旱苔蘚植物DNA提取及優(yōu)化RAPD、ISSR反應(yīng)體系的建立［J］.中國沙漠，2006，26（5）：826-831.

［13］Nei M，Li W H.Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1979，76：5269-5273.

［14］Longton R E.Genecological differentiation in bryophytes［J］.Journal of Hattori Botanical Laboratory，1974，38：48-65.

［15］崔明昆.苔蘚植物的生態(tài)變異及其分類學(xué)中的生態(tài)學(xué)準(zhǔn)則［J］.云南師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2001，21（4）：61-64.

Study on the Classification of
Cratoneuronfilicinum（Hedw.）Spruce by RAPD

LI Peng-bo1，WU Yu-huan1，2，LUO Hao2

（1.College of Life and Envionmental Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China；2.Institute of Applied Ecology，Chinese Academy of Sciences，Shenyang 110016，China）

Choosing nineCratoneuronfilicinumspecimens collected from Sichuan，Gansu，Hunan，Yunnan，Liaoning，Hebei，Jilin and Xinjiang as the materials，the paper researched on the taxonomic revision of differentC.filicinumby RAPD，obtained 134distinct bands from 15primers，of which 91.79%were polymorphic，and the genetic similarity coefficient（GS）among nineC.filicinumspecimens varied from 0.703to 0.870.The results showed that the individuals of nine specimens are the same specie though they are very different in morphological characteristics.

Cratoneuronfilicinum；RAPD；taxonomic revision；environment modification

Q949

A

1674-232X（2011）03-0237-05

10.3969／j.issn.1674-232X.2011.03.010

2010-12-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30770161，30970188）；杭州師范大學(xué)科研啟動基金項(xiàng)目（YS05203130）.

李鵬勃（1986—），男，陜西周至人，植物學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事植物系統(tǒng)進(jìn)化與生態(tài)學(xué)研究.

＊通信作者：吳玉環(huán)（1972—），女，浙江蒼南人，教授，博士，主要從事植物系統(tǒng)進(jìn)化與生態(tài)學(xué)研究.E-mail：yuhuanwu＠yahoo.com.cn