轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜飼喂小鼠的安全性研究

應(yīng)奇才，徐祥彬，薛大偉，潘慧娟，王慧中

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310036）

轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜飼喂小鼠的安全性研究

應(yīng)奇才，徐祥彬，薛大偉，潘慧娟，王慧中＊

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310036）

轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜的小鼠急性和亞急性毒性試驗、致突變試驗以及30d喂養(yǎng)安全性分析試驗.其小鼠經(jīng)口急性毒性半致死量LD50＞90g/kg體重試驗，表明該轉(zhuǎn)基因食品屬實際無急性毒性物質(zhì)；微核實驗和精子畸變實驗及Ames實驗均未發(fā)現(xiàn)有致突變作用；30d喂養(yǎng)試驗，54、108、162g/kg體重各劑量組小鼠發(fā)育、增重、食物利用率、血常規(guī)、臟體比及病理組織學(xué)等各項指標和基礎(chǔ)對照組比較均無顯著性差異.上述結(jié)果初步表明轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜對小鼠沒有毒性，屬安全食品.

轉(zhuǎn)基因甜瓜；WMV－2CP基因；毒性試驗；致突變試驗；喂養(yǎng)實驗

甜瓜（Cucumismelo）屬葫蘆科，一年蔓生草本植物，原產(chǎn)于非洲熱帶沙漠地區(qū)，大約在北魏時期隨著西瓜一同傳到中國，明朝開始廣泛種植.現(xiàn)在我國各地普遍栽培，果肉生食，止渴清燥，可消除口臭，但瓜蒂有毒，生食過量，即會中毒.近年來，由于病毒病的危害，品質(zhì)和產(chǎn)量不斷下降，有些地區(qū)發(fā)病率高達100%，造成較大經(jīng)濟損失.侵染甜瓜的病毒主要是西瓜花葉病毒2號、黃瓜花葉病毒和南瓜花葉病毒，其中WMV－2是甜瓜病毒病中發(fā)病最嚴重的毒源，占田間病株90%以上.隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，將抗真菌蛋白基因轉(zhuǎn)入植物來提高農(nóng)作物對真菌病害的抵抗能力.王慧中等［1－2］已將WMV－2病毒的外殼蛋白基因（WMV－2CP）導(dǎo)入華南108甜瓜培育出甜瓜抗病新品種.攻毒試驗表明，轉(zhuǎn)基因的甜瓜對毒源有很強的抗性；田間試種發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，轉(zhuǎn)基因株系較非轉(zhuǎn)基因推遲WMV－2病毒發(fā)病時間，減輕發(fā)病程度，顯著減輕了病毒病造成的損失，具有良好的推廣價值.

自20世紀90年代中期抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化以來，在政治家、社會活動家和消費者中間，特別是在歐洲，對轉(zhuǎn)基因食品的安全性憂慮不斷增多.同樣，轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜食品是否安全也須科學(xué)評估，故本實驗室在參考藥物、食品添加劑的健康安全性評價的基礎(chǔ)上［3－4］，對轉(zhuǎn)WMV－2CP基因華南108甜瓜進行了毒性試驗、致突變試驗和小鼠30d喂養(yǎng)試驗，獲取了一些有效的實驗數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用ICR小鼠由杭州師范大學(xué)實驗動物中心提供.

轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜、未轉(zhuǎn)基因華南108甜瓜由杭州師范大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點實驗室提供，實驗前去皮去子，打成勻漿.

菌株TA97、TA98、TA100、TA102由上海市勞動衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究所提供，生物學(xué)鑒定合格.

1.2 急性毒性試驗

選健康、成年、體重20g左右ICR小鼠40只，雌雄各半.隨機分90g/kg體重轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜劑量組和陰性對照組，每組20只，雌雄各半.取轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜勻漿，24h內(nèi)灌胃分2次進行，而后連續(xù)觀察10d.10d后處死小鼠，觀察小鼠的肝、腎、脾、胸腺等臟器的形態(tài)特征.

1.3 亞急性毒性試驗

選健康、成年、體重25g左右ICR小鼠40只，雌雄各半.隨機分轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜組和陰性對照組，每組20只，雌雄各半.取轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜勻漿，每天灌胃1次，每次30g/kg體重，連續(xù)灌胃14d，然后觀察10d.10d后處死小鼠，觀察小鼠的肝、腎、脾、胸腺等臟器的形態(tài)特征.

1.4 致突變試驗

方法參照《實用毒理學(xué)手冊》［5］.

1.4.1 微核試驗

選健康、成年、體重25g左右ICR小鼠160只，雌雄各半.小鼠隨機分15、30、60g/kg體重3個轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜劑量組，15、30、60g/kg體重3個正常甜瓜劑量組，一個陰性組（水）和一個陽性對照組（環(huán)磷酰胺80mg/kg體重），每組20只，雌雄各半.小鼠間隔24h連續(xù)灌胃2次，第2次灌胃后6h處死.取胸骨骨髓制成骨髓片，Gimsa染色.每只小鼠記數(shù)嗜多染紅細胞1 000只，計算微核率.

1.4.2 精子畸變試驗

選取健康、成年、體重25g左右雄性ICR小鼠80只，小鼠隨機分15、30、60g/kg體重3個轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜劑量組，15、30、60g/kg體重3個正常甜瓜劑量組，一個陰性對照組（水）和一個陽性對照組（絲裂霉素C 0.004mg/kg體重），每組10只.小鼠分別用轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜勻漿及對照甜瓜勻漿連續(xù)灌胃30d，最后一次灌胃24h后處死，分別取兩側(cè)附睪，制成吸濾液直接涂片，伊紅染色，高倍鏡下觀察精子形態(tài)并計數(shù)，每只小鼠計數(shù)完整精子1 000條，計算精子畸形發(fā)生率.

1.4.3 Ames試驗

試驗菌株采用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97、TA98（移碼型突變株）和TA100、TA102（堿基置換型突變株）.轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜勻漿過篩200目，用TA100菌株的非代謝活性系統(tǒng)進行預(yù)試，結(jié)果在劑量為15 000μg/皿時未出現(xiàn)明顯的抑菌或增菌現(xiàn)象，正式試驗時選擇試驗濃度為20 000、15 000、10 000、5 000、1 000、250μg/皿6個轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜劑量組，外加陰性對照和陽性對照.采用標準平板摻入法，需要代謝活化時加入用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿作為體外代謝活化系統(tǒng)，37℃培養(yǎng)箱孵育48h，計數(shù)回變菌落數(shù).實驗重復(fù)3次.

1.5 小鼠30d喂養(yǎng)試驗

選取健康、成年、體重18～22g ICR小鼠140只，雌雄各半，小鼠隨機分54、108、162g/kg體重3個轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜劑量組（A），54、108、162g/kg體重3個正常甜瓜劑量組（B），另設(shè)一個基礎(chǔ)對照組（基礎(chǔ)飼料），基礎(chǔ)飼料含熱能1.73kJ/kg，水分7.43%，粗蛋白22.64%，粗脂肪4.85%，粗纖維3.35%，粗灰分6.97%，鈣1.33%，磷0.76%，食鹽0.55%，無氮浸出物55.63%，每組10只，雌雄各半.

基礎(chǔ)飼料配方：麥粉18%、面粉18%、黃豆粉18%、玉米粉18%、米粉18%、魚粉8%、骨粉1%、酵母粉1%；36g/kg體重轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜劑量組飼料配方：基礎(chǔ)飼料配方中的18%米粉用轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜勻漿（甜瓜勻漿中平均含水80%～85%，18%米粉用3倍的甜瓜勻漿配制后烘干）代替；72g/kg體重轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜劑量組飼料配方：基礎(chǔ)飼料配方中的18%米粉及18%面粉用3倍的轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜勻漿代替；108g/kg體重轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜劑量組飼料配方：基礎(chǔ)飼料配方中的18%米粉、18%面粉和18%玉米粉用3倍的轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜勻漿代替；36、72、108g/kg體重3個正常甜瓜劑量組飼料配方同于轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜劑量組飼料配方，只是用正常甜瓜勻漿代替轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜勻漿.

小鼠2只每籠飼養(yǎng)，自由進食飲水，飼料配比為體重的10%.連續(xù)觀察30d，每周記錄體重和進食量并計算食物利用率，實驗結(jié)束時斷頭取血、處死，對每只小鼠進行臟器大體觀察，同時取肝、腎稱重并計算臟體比，對血進行血象、血生化檢查.

取肝、腎、胃、腸組織分別固定在10%的福爾馬林中，石蠟包埋，間斷連續(xù)切片，切片厚5μm，HE染色，對照組和實驗組的切片同時進行染色，然后光學(xué)顯微鏡下觀察對比.

檢驗組織損傷判別標準：正常組織為“－”，變形的組織按損傷程度的輕與重分成為“＋”和“＋＋”二個等級.

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

各組計量資料以x±s表示，數(shù)據(jù)處理采用DPS3.01中文數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行方差分析和單因素多重比較.以P＜0.01表示顯著性差異.

2 結(jié) 果

2.1 急性毒性試驗結(jié)果

喂養(yǎng)期間，所有小鼠均未見明顯癥狀，沒有死亡；觀察小鼠的肝、腎、脾、胸腺等臟器均無異常變化，病理檢查各臟器均無異常改變，證明轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜對雌雄小鼠經(jīng)口LD50均大于90g/kg體重，說明毒性極微或沒有毒性.

2.2 亞急性毒性試驗結(jié)果

喂養(yǎng)期間，所有小鼠均未見明顯癥狀，沒有死亡；觀察小鼠的肝、腎、脾、胸腺等臟器均無異常變化，病理檢查各臟器均無異常改變，證明轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜毒性極低或沒有毒性，對小鼠來說食用是安全的.

2.3 致突變試驗結(jié)果

2.3.1 微核試驗結(jié)果

轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜和正常甜瓜對小鼠微核率的影響見表1.

表1 轉(zhuǎn)基因和正常甜瓜對小鼠微核率的影響Tab.1 Effect of transgenic Cucumis melo on micronucleirate of mice

雌雄各劑量組（包括轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜各劑量組和正常甜瓜各劑量組）與陰性對照組之間的微千分率經(jīng)t檢驗，P均＞0.05，顯示微千分率在雌雄各劑量組與陰性對照組之間無顯著性差異；陽性對照組的微千分率顯著高于陰性對照組，經(jīng)t檢驗，P＜0.01，顯示其差異有非常顯著性意義.表明轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率未見明顯影響，檢測結(jié)果顯陰性.

2.3.2 小鼠精子畸形試驗結(jié)果

轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜和正常甜瓜對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響見表2.各轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜劑量組與陰性對照組之間的精子畸形發(fā)生率經(jīng)t檢驗，P＞0.05，顯示小鼠精子畸形發(fā)生率在各轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜劑量組和陰性對照組之間均無顯著性差異；各轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜劑量組與相應(yīng)正常甜瓜對照組之間的精子畸形發(fā)生率經(jīng)t檢驗，P均＞0.05，顯示小鼠精子畸形發(fā)生率在轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜各劑量組與相應(yīng)正常甜瓜對照組之間均無顯著性差異；陽性對照組與陰性對照組之間，經(jīng)t檢驗，P均＜0.01，顯示陽性對照組與陰性對照組之間達顯著性差異.轉(zhuǎn)基因甜瓜檢測結(jié)果為陰性.

表2 轉(zhuǎn)基因甜瓜對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響Tab.2 Effect of transgenic watermelon on aberrant sperms rate of mice

2.3.3 Ames試驗結(jié)果

各菌落回變菌落數(shù)結(jié)果如表3所示.從表3可知，不同濃度受試物在加和不加S9條件下的回變菌落與陰性對照組相近，陽性對照回變菌落數(shù)高于陰性對照回變菌落數(shù)2倍以上.轉(zhuǎn)基因西瓜Ames試驗檢測結(jié)果為陰性.

2.4 小鼠30d喂養(yǎng)試驗結(jié)果

結(jié)果如表4所示，試驗期間小鼠生長良好，無異常征狀和體征，也無死亡；血常規(guī)檢查顯示白細胞、血色素均在正常范圍內(nèi)；生化指標（谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血清總蛋白、清蛋白、尿素氮、血糖）均在正常范圍內(nèi)［6］；解剖時大體觀察未見異常，臟器系數(shù)各劑量組與陰性對照組比較無顯著性差異.

2.5 組織病理學(xué)觀察結(jié)果

在光學(xué)顯微鏡下觀察對照組和各劑量組小鼠的肝、腎、胃腸均未見有意義的病理改變（表5）.

表3 轉(zhuǎn)基因甜瓜Ames試驗檢測結(jié)果Tab.3 Results of Ames test of transgenic Cucumis melo

表4 轉(zhuǎn)基因甜瓜對小鼠增重、食物利用率及血生化指標的測定Tab.4 Effect of transgenic Cucumis melo on weight food utilization rate and blood components of Mice

表5 轉(zhuǎn)基因甜瓜對小鼠臟器的影響Tab.5 Effect of transgenic Cucumis melo on viscera of Mice

3 討 論

轉(zhuǎn)基因食品（genetically modified food，GM food）是指利用基因工程技術(shù)改造基因組構(gòu)成的食品［7］，為解決糧食短缺、資源匱乏、環(huán)境污染等問題提供了契機.

轉(zhuǎn)基因食品在給人類帶來巨大利益的同時，也給人類健康和環(huán)境安全帶來潛在的風(fēng)險.自斑蝶事件［8－9］報道以來，引起了人們的極大關(guān)注.因此，轉(zhuǎn)基因食品的安全管理受到了世界各國的重視，其安全性評價是安全管理的核心和基礎(chǔ)之一.其中，轉(zhuǎn)基因食品的毒理學(xué)評價，如免疫毒性、神經(jīng)毒性、致癌性、繁殖毒性以及是否有過敏源等是安全性評價的重要內(nèi)容之一［10］.

當前轉(zhuǎn)基因食品的安全性評價主要集中在水稻、玉米等糧食作物上，轉(zhuǎn)基因甜瓜的安全性評價還未見報道.通過對小鼠的急性毒性實驗、微核實驗、精子畸變實驗及Ames實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)抗除草劑基因（bar）水稻屬實際毒性極微或無毒類物質(zhì)，表明轉(zhuǎn)bar基因水稻對小鼠是安全的［11］.同樣在轉(zhuǎn)耐鹽基因水稻和西瓜中也得到相似結(jié)果［12－14］.但是據(jù)Finamore等［15］研究報告，在食用含50%轉(zhuǎn)基因玉米（Mon810）飼料后，斷奶幼鼠（出生21d）和成年鼠（出生18～19個月）的腸和外周免疫反應(yīng)出現(xiàn)了異常.其中，斷奶幼鼠在連續(xù)30d食用含轉(zhuǎn)基因玉米飼料后，淋巴細胞、脾和血淋巴細胞的免疫表型都出現(xiàn)異常.成年鼠也在連續(xù)90d食用含轉(zhuǎn)基因玉米的飼料后，淋巴細胞和血淋巴細胞的免疫表型也出現(xiàn)異常，這意味表明轉(zhuǎn)基因玉米食品也可能會給人類健康帶來不良影響.因此對轉(zhuǎn)基因食品的商業(yè)化審批必須謹慎，同時應(yīng)加強對轉(zhuǎn)基因食品安全性評價的研究.

通過轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜對小鼠的急性毒性試驗、亞急性毒性試驗、致突變試驗和小鼠30d喂養(yǎng)試驗的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜對成年小鼠來說食用是安全的.該研究結(jié)果只是一個初步結(jié)論，還需要對斷奶幼鼠、成年鼠及連續(xù)多代食用轉(zhuǎn)WMV－2CP基因甜瓜安全性作進一步的研究.

其實，轉(zhuǎn)基因作物最大的危害是對作物本身.由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，各種優(yōu)勢基因都可以非常容易地轉(zhuǎn)到目標作物上，這對植物的多態(tài)性是一種傷害.而且，如果人類對植物的多態(tài)性保護不夠，這種傷害是不可逆的.

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Safety Assessment of Transgenic Cucumis Melo withWMV－2CPGene

YING Qi－cai，XUE Da－wei，XU Xiang－bin，PAN Hui－juan，WANG Hui－zhong

（College of Life and Environment Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China）

Safety assessment of virus－resistant transgenic Cucumis melo was carried out.Toxicity experiments，mutation experiments，and 30－d feeding test were conducted on mice with transgenic Cucumis melo bearingWMV－2CPgene.The results show that oral LD50for mice is larger than 90g/kg so that the transgenic Cucumis melo belongs to nontoxic food.No mutation is found in micronucleus test，spermium aberration test or Ames test.The mice groups with 54，108，162g/kgdosage have good development in 30－day feeding test.No obvious differences are found in the index of weight，food utilization rate，routine blood test，rate of organ to body（weight to weight），and patho－h(huán)istological observations between mice fed with or without the transgenic Cucumis melo.It shows that transgenic watermelon withWMV－1CPgene is safe to mice.

transgenic Cucumis melo；WMV－2CPgene；toxicity experiment；mutation experiment；feeding test

S651

A

1674－232X（2011）05－0422－07

10.3969/j.issn.1674－232X.2011.05.008

2011－01－26

浙江省自然科學(xué)基金項目（393105）；錢江人才計劃資助項目.

應(yīng)奇才（1965—），男，浙江永康人，高級實驗師，主要從事生物化學(xué)與免疫學(xué)研究.E－mail：yingqicai＠163.com＊

王慧中（1962—），男，浙江義烏人，教授，博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究.E－mail：whz62＠163.com