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    一株魚潰瘍致病菌的分離及鑒定

    2011-12-22 07:34:30胡健饒章麗梅史雨紅
    關(guān)鍵詞:美人魚弧菌青霉素

    胡健饒,章麗梅,史雨紅,陳 炯

    (1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310036;2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,浙江寧波 315211)

    胡健饒1,章麗梅1,史雨紅2,陳 炯2

    (1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310036;2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,浙江寧波 315211)

    該研究從寧波市象山港魚養(yǎng)殖區(qū)患病魚腎臟中分離到1株優(yōu)勢菌Mm041,人工回感試驗(yàn)確定該菌株為致病菌株,測定其對魚的半致死量為3.0×106CFU.通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征鑒定,并結(jié)合細(xì)菌16SrRNA基因序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析,確定Mm041為美人魚發(fā)光桿菌.藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,該菌株對氯霉素、羧芐青霉素、頭孢哌酮(先鋒必)高度敏感.

    魚;美人魚發(fā)光桿菌;鑒定

    1 材料和方法

    1.1 材料

    大腸桿菌EscherichiacoliTG1由該試驗(yàn)保存,T4DNA連接酶、pMD19-T Simple Vector和Ex Taq DNA聚合酶均購自Takara公司,Gel Extraction Kit購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司,Plasmid MiniKit購自O(shè)mega公司.細(xì)菌鑒定管和藥敏紙片購自杭州天河微生物試劑有限公司.引物合成及測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成.

    1.2 病原菌的分離

    1.3 病原菌的人工回感試驗(yàn)和半致死量測定

    將菌株Mm041接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,于28℃過夜培養(yǎng),用0.9%的滅菌生理鹽水洗滌菌體,經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)法確定菌懸液濃度為3.0×109CFU/mL,10倍梯度稀釋后備用.試驗(yàn)共分6個(gè)組(5個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對照組),每組12尾魚,試驗(yàn)水溫為(20±1)℃.馴養(yǎng)7d后,試驗(yàn)組每尾魚分別腹腔注射0.1mL10倍梯度稀釋的菌懸液,對照組每尾腹腔注射等劑量的滅菌生理鹽水.注射后每日觀察試驗(yàn)魚的發(fā)病癥狀和死亡情況,并對死亡魚體進(jìn)行解剖和病原菌的再分離.采用Aliu和Nwude[2]改進(jìn)的寇氏法計(jì)算Mm041在20℃左右時(shí)對平均體重約150g魚的半致死量:lgLD50=Xk-d(∑Pi-0.5),其中Xk為最大劑量對數(shù),d為相鄰兩組對數(shù)劑量之差數(shù),Pi為死亡率,i為組號.

    1.4 病原菌體形態(tài)觀察

    觀察菌株Mm041在普通營養(yǎng)瓊脂和TCBS平板上菌落的形態(tài)特征,并取純培養(yǎng)物制備相應(yīng)的涂片,革蘭氏染色后于普通光鏡下觀察菌體的形態(tài)和大小.對Mm041進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染,晾干后,透射電鏡觀察其個(gè)體形態(tài)、大小和鞭毛結(jié)構(gòu)等.

    1.5 生理生化特征鑒定

    參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[3]和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》[4]中的形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo),對分離菌株Mm041進(jìn)行鑒定.

    1.6 16S rRNA基因的擴(kuò)增、測序和分析

    1.6.1 基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

    采用已報(bào)道的細(xì)菌16SrRNA基因通用擴(kuò)增引物[5]進(jìn)行PCR擴(kuò)增.采用Wilson[6]所描述的方法提取分離菌株的基因組DNA.PCR反應(yīng)體系為:基因組DNA 0.5μL,10×Ex Taq PCR緩沖液(含MgCl2)2.5μL,dNTP混合物(各2.5mol/L)2μL,上下游引物(10pmol/L)各1μL和Ex Taq DNA聚合酶1 U,補(bǔ)充滅菌水至總體積25μL.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min;94℃變性30s,58℃退火90s,72℃延伸90s,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min.

    1.6.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測序

    1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,回收目的條帶后,將純化后的PCR產(chǎn)物克隆至pMD19--T Simple Vector,并轉(zhuǎn)化E.coliTG1,經(jīng)藍(lán)白斑篩選后抽提質(zhì)粒,PCR擴(kuò)增鑒定獲得陽性克隆.陽性克隆送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序.

    1.6.3 序列分析

    將獲得的16SrRNA基因序列進(jìn)行BLAST分析(www.ncbi.nlm.nih.gov/),選取10株與Mm041同源性相似的細(xì)菌16SrRNA基因序列,采用ClustalW軟件(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/)對Mm041與10株細(xì)菌16SrRNA基因序列進(jìn)行多重序列比對分析,采用MEGA 4.0軟件(Neighborjoining法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹.

    1.7 藥物敏感性試驗(yàn)

    取100μL Mm041菌懸液(3×109CFU/mL)涂布于普通營養(yǎng)瓊脂平板,用滅菌鑷子分別取藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面,28℃恒溫培養(yǎng)16~18h,測定抑菌圈直徑大小,根據(jù)說明書標(biāo)準(zhǔn)判斷Mm041對各類抗生素的敏感性和抗藥性.

    2 結(jié) 果

    2.1 分離菌株的致病性

    2.2 菌體的形態(tài)及生理生化特征

    供試純培養(yǎng)菌菌株Mm041的形態(tài)特征為革蘭氏陰性,在鏡下可見菌體粗短、兩端鈍圓、呈桿狀、多單個(gè)散在和個(gè)別成雙排列的革蘭氏陰性菌.大小多在(0.6~1.0)×(1.0~2.0)μm的桿菌(見圖1).可運(yùn)動(dòng),經(jīng)透射電鏡觀察,絕大多數(shù)菌體具一根長的極生單鞭毛(見圖1).將Mm041在普通營養(yǎng)瓊脂平板上28℃培養(yǎng)24h后,菌落呈圓形,半透明,直徑約1.5mm,邊緣整齊,中央隆起,表面光滑濕潤.在TCBS瓊脂平板上能生長,菌落呈綠色,菌落圓形光滑、邊緣整齊、較隆起.

    生理生化特征鑒定結(jié)果見表1.Mm041為氧化酶、接觸酶、脲酶等陽性;V-P試驗(yàn)和靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性、鳥氨酸脫羧酶陰性;利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖等,且發(fā)酵葡萄糖,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;對弧菌抑制劑O/129(2,4-二氨基-6,7-二異丙基喋啶磷酸鹽)(150μg或10μg)敏感.參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[3]和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》[4],菌株Mm041生化特征與美人魚發(fā)光桿菌最為接近.

    圖1 菌株Mm041的透射電鏡照片(15000 x)Fig.1 The transmission electron microscope image of the strain Mm041(15000x)

    表1 Mm041分離菌的理化特性Tab.1 Physiological and chemical characteristics of the isolated strain Mm041

    2.3 細(xì)菌16SrDNA擴(kuò)增及序列分析

    以菌株Mm041的基因組DNA為模板,采用已報(bào)道的細(xì)菌16SrRNA基因通用擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,目的片段克隆后測序,其16SrRNA基因序列EMBL登錄號為FR687000.

    細(xì)菌16SrRNA基因核苷酸序列比較分析表明,Mm041與美人魚發(fā)光桿菌核苷酸序列同源性最高,為98.8%~99.6%,與其它發(fā)光桿菌屬成員同源性分別為94.7%~96.8%,與弧菌屬成員為92.4%~95.1%.16SrRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,Mm041與美人魚發(fā)光桿菌系統(tǒng)進(jìn)化相關(guān)性最高,與同屬的其它成員進(jìn)化相關(guān)性次之,與同科的弧菌屬成員進(jìn)化相關(guān)性較遠(yuǎn),但與同屬其他成員進(jìn)化相關(guān)性較遠(yuǎn)(圖2),說明菌株Mm041為美人魚發(fā)光桿菌(即原弧菌屬的美人魚弧菌)的一個(gè)分離物.

    圖2 基于部分弧菌科成員16SrRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by the nucleotide sequences of 16SrRNA genes from some bacterias of Vibrionaceae

    2.4 藥物敏感性

    在所測試的10種抗菌藥物中,Mm041對新生霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素(氨芐西林)、青霉素G、先鋒霉素V(頭孢唑啉)等5種藥物均具有耐藥性,對鏈霉素和丁胺卡那霉素中毒敏感,而對氯霉素、羧芐青霉素、頭孢哌酮(先鋒必)高度敏感.

    3 討 論

    美人魚發(fā)光桿菌包括美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種(P.damselaesubsp.damselae)(即原來的美人魚弧菌)和美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(P.damselaesubsp.piscicida)兩個(gè)亞種.廣泛存在于海水及海產(chǎn)動(dòng)物中.1981年Love等[7]首次從患皮膚潰瘍病的少女魚病灶處分離到了美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種,即海魚弧菌.目前,已報(bào)道美人魚發(fā)光桿菌感染皮革龜(Dermochelyscoriacea,leatherback turtles)[8]、樽鼻海豚(Tursiopstruncates,bottlenose dolphins)[9]、五條(Seriolaquinqueradiata,yellowtail)[10]、金頭鯛(Sparusaurata,gilthead sea bream)[11]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus,turbot)[12]、澳洲龍魚(Lates calcarifer,barramundi)[13]等.此外,從患病蝦、蟹和鱉中也分離到美人魚發(fā)光桿菌[14-16].可以引起多種海水魚的敗血病,也可以感染人體,能致人傷口感染,引起感染性腹瀉[17].

    文章綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析,表明分離到的Mm041菌株為美人魚發(fā)光桿菌的一個(gè)分離物,進(jìn)一步證明了美人魚發(fā)光桿菌具有廣泛的致病性.此外,該分離物對新生霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素(氨芐西林)、青霉素G和先鋒霉素V(頭孢唑啉)耐藥,而對氯霉素、羧芐青霉素和頭孢哌酮(先鋒必)高度敏感,與其他作者分離到的美人魚發(fā)光桿菌藥敏感性略有差異[16,18],這可能由于養(yǎng)殖戶頻繁使用各類抗生素,導(dǎo)致細(xì)菌變異對部分藥物產(chǎn)生耐藥性.因此在用藥進(jìn)行病害防治時(shí),最好能對分離菌株進(jìn)行藥物敏感性檢測后再選擇合適藥物進(jìn)行治療.

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    Isolation and Identification of A Pathogenic Bacterium Causing Ulcer Disease of Miiuy Croaker(MiichthysMiiuy)

    HU Jian-rao1,ZHANG Li-mei1,SHI Yu-h(huán)ong2,CHEN Jiong2

    (1.College of Life and Environment Sciences,Hangzhou Normal University,Hangzhou 310036,China;
    2.Ministry of Education Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

    The experment islated,a dominant bacterial species,termed as Mm041from the kidney of a diseased miiuy croaker(Miichthysmiiuy).By artificial infection tests,Mm041was characterized to be the pathogenic bacterium causing ulcer disease of miiuy croaker,and its LD50was 3.0×106CFU.Based on the biological characteristics and 16srRNA sequence analysis,Mm041was classified as an isolate ofPhotobacteriumdamselae.The result of the antibiotic sensitivity test show that Mm041is highly sensitive to chloramphenicol,carbenicillin and cefoperazone.

    Miichthysmiiuy;Photobacteriumdamselae;identification

    S943

    A

    1674-232X(2011)05-0444-05

    10.3969/j.issn.1674-232X.2011.05.011

    2010-03-20

    浙江省科技廳科研計(jì)劃項(xiàng)目(2009C32059;2010C32090).

    胡健饒(1967—),男,浙江蕭山人,副教授,博士,主要從事動(dòng)物生理學(xué)研究.E-mail:hujianrao@126.com

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