一株海洋細菌對中肋骨條藻的溶解效應及其溶藻特性

汪 輝,劉 玲,牛丹丹,劉兆普 (南京農業(yè)大學江蘇省海洋生物學重點實驗室,江蘇 南京 210095)

一株海洋細菌對中肋骨條藻的溶解效應及其溶藻特性

汪 輝,劉 玲,牛丹丹,劉兆普*(南京農業(yè)大學江蘇省海洋生物學重點實驗室,江蘇 南京 210095)

從山東膠州灣分離得到1株海洋溶藻菌,暫將其命名為JZ-1.根據(jù)生理生化及16S rDNA 序列分析鑒定,菌株JZ-1屬于交替單胞菌屬(Alteromonas).研究表明,菌株 JZ-1對中肋骨條藻具有很好的溶解效果,它能夠破壞藻細胞膜內物質的結構和細胞膜的完整性,使細胞膜內物質流出導致藻細胞死亡.溶藻現(xiàn)象發(fā)生在細菌培養(yǎng)液的上清液和0.2μm的過濾液中,而不是在細菌菌體中,這表明菌株JZ-1通過分泌代謝物對中肋骨條藻產生溶解作用,且當菌株JZ-1由對數(shù)生長期向穩(wěn)定期過渡時,其代謝物的溶藻率達到最大.代謝物分子量＜5kD,具有熱穩(wěn)定性、耐酸性,但不耐堿.

海水富營養(yǎng)化；中肋骨條藻；溶藻細菌；溶藻機理

海水富營養(yǎng)化程度加劇,海洋赤潮的暴發(fā)已成為世界各國所面臨的重大生態(tài)災害[1-2],對人類健康的威脅日益顯著,對社會經濟、海洋資源、生態(tài)環(huán)境以及人工水產養(yǎng)殖都造成極大的損害

[1-3].我國近岸海域赤潮發(fā)生的頻率、波及范圍和危害程度也呈上升趨勢[4-5].中肋骨條藻作為一種在中國東部沿海廣泛存在的廣溫廣鹽性的浮游硅藻,是易誘發(fā)赤潮產生的藻類之一[6].

與物理和化學控藻方法相比,生物控藻已成為防治赤潮和水華的一個新的研究方向[7-10],其中溶藻細菌被公認為是目前極具潛力的生物控藻新技術[11-12].溶藻細菌是指通過直接或間接方式,抑制藻類生長或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌[13-14].Doucette等[15]曾報道在水華和赤潮的發(fā)生、發(fā)展和消亡過程中,細菌以及細菌與藻類的相互作用是影響藻類生長的關鍵性的調控因素.

本實驗室從膠州灣分離出一株溶中肋骨條藻有很好溶解作用的海洋細菌,暫時命名為 JZ-1.經過生理生化及16S rDNA 序列分析,鑒定出此菌株屬于交替單胞菌屬.本研究進一步探討了該溶藻細菌對中肋骨條藻生理生態(tài)的影響和溶藻機理,并對細菌分泌的代謝物的性質進行研究,為更深入的研究溶藻細菌和探討藻菌關系提供參考.

1 材料與方法

1.1 藻種來源及其培養(yǎng)

實驗藻種為中肋骨條藻(Skeletonema costatum),由暨南大學水生生物研究所提供.藻種經活化后,采用f/2培養(yǎng)基[16],在溫度為20℃,光照強度為50 μmol /(m2?s),光暗比為12h:12h的條件下 培 養(yǎng) .培 養(yǎng) 基 成 分 為 :NaNO375mg, NaH2PO4·H2O 5mg,Na2EDTA 4.36mg,FeCl3·6H2O 3.15mg,CuSO4·5H2O 0.01mg,ZnSO4·7H2O 0.022mg, CoCl2·6H2O 0.01mg,MnCl2·4H2O 0.18mg, Na2MoO4·2H2O 0.006mg,硫胺素· HCl 0.1mg,生物素 0.5μg,維生素 B120.5μg.1L過濾海水.通過顯微鏡觀察及血球計數(shù)板來觀察中肋骨條藻細胞生長情況.

1.2 溶藻細菌的分離

從膠州灣的不同區(qū)域采集水樣,將中肋骨條藻接到采集的水樣中,通過血球計數(shù)板來觀察中肋骨條藻的生長情況.將能夠使藻液黃化的原水樣按一定的梯度稀釋,并接入MB瓊脂固體平板中培養(yǎng),多次重復直到得到單個菌落.將各個單菌落富集培養(yǎng),并接種到試驗藻中測試溶藻效果.MB瓊脂培養(yǎng)基成分為:蛋白胨5g,酵母粉1g,瓊脂15g.1L過濾海水.

1.3 細菌生理生化及分子生物學鑒定

細菌生理生化鑒定[17]:將細菌進行革蘭氏和芽孢染色,于光學顯微鏡下觀察染色結果;進行碳源和氮源利用試驗.

16S rDNA序列分析:按Pitcher法提取細菌的基因組總DNA;以提取的DNA為模板,采用通用引物(正向 27F:5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向1495R:5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)進行 16S rRNA基因擴增.反應條件:96℃預變性 5min;95℃變性 30s;52℃退火1min 30s;72℃延伸 1min 30s;30個循環(huán),延伸10min.PCR 產物經檢測純化后.直接用 Taq DyeDeoxy Terminator cycle Sequencing Kit測序電泳及數(shù)據(jù)收集用 Applied T3iosystems DNA Sequences(model 377)自動進行.將所測的 16S rDNA序列經校對后.在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比較.

1.4 液體溶藻試驗

將菌株JZ-1的單菌落接種到MB培養(yǎng)基中,在20℃下振蕩富集培養(yǎng)3d,使其密度達到107個/ mL.取10mL菌液加入100mL處于對數(shù)生長期的中肋骨條藻藻液中,設3個平行實驗,每天觀察藻液顏色變色,且每隔 2d定時取樣,在光學顯微鏡下觀察細胞損壞情況,并用血球計數(shù)板測量完整無損壞細胞的數(shù)量.

1.5 熒光顯微鏡下觀察藻細胞變化

將菌株 JZ-1單菌落如上所述富集培養(yǎng),取1mL菌液加入10mL處于對數(shù)生長期的中肋骨條藻藻液中,每 8h取樣染色,采用氟硼熒作為熒光染色劑,在熒光顯微鏡下觀察藻細胞形態(tài).

1.6 溶藻機理的探討

采用一次性培養(yǎng)方式將藻液培養(yǎng)至對數(shù)生長期,富集培養(yǎng)菌株 JZ-1,將細菌培養(yǎng)液與中肋骨條藻混合培養(yǎng);另外,在8000r/min將細菌培養(yǎng)液離心 8min,分離上清液與菌體沉淀.取 10mL上清液加入100mL藻液中,進行溶藻試驗;將菌體沉淀溶于 f/2培養(yǎng)基中,取其 10mL加入100mL藻液中,重復液體溶藻試驗;另外,用0.2μm 濾膜過濾菌液,取10mL濾液加入100mL藻液中,重復液體溶藻試驗.采用未進行任何處理的中肋骨條藻作為空白對照,進行液體溶藻試驗.所有處理均重復 3次.定時取樣,光學顯微鏡下計完整藻細胞數(shù).

1.7 代謝物溶藻試驗

將菌株 JZ-1單菌落接種至 MB培養(yǎng)基中,20℃下連續(xù)振蕩富集培養(yǎng) 7d.自接種之日起,每天定時取 50mL細菌培養(yǎng)液用作代謝物提取.細菌培養(yǎng)液經8000r/min離心10min后收集上清液,加入2.5g離子交換樹脂振蕩混合過夜.用一小團棉球封住 20mL塑料針管的底部,將上清液與離子交換樹脂的混合物注入針管中,液體隨針孔流下,而樹脂因為棉球的阻礙而留下棉球上方.然后用 20mL乙酸乙酯溶液洗脫代謝物,并于旋轉蒸發(fā)儀中蒸發(fā)得到代謝物.

采用雙層瓊脂平板法進行固體培藻:取100mL對數(shù)生長期的中肋骨條藻經3000r/min離心 8min后,收集藻體.將藻體與 2.5mL微熱的0.4%的 f/2軟瓊脂培養(yǎng)基混合,混勻后立即倒入事先準備好的濃度為 1.5%的 f/2硬瓊脂培養(yǎng)基上鋪平.

代謝物的溶藻效率采用濾紙片法[18]來測定:用少量的水溶解代謝物,用移液槍吸取 10μL代謝物至預先平鋪在固體藻上的0.6mm的濾紙片上.將平板放于 20℃下過夜培養(yǎng),根據(jù)抑藻圈的大小來計算代謝物的溶藻率.

1.8 代謝物性質的初步研究

酸堿適應性:分別用 0.1mol/L的 HCl和0.1mol/L NaOH 溶液以10% 的濃度來處理代謝物.30min后,再分別用相同濃度的 0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L HCl來調整pH值至中性.以未經處理的代謝物為空白對照,設立3個平行實驗,用濾紙片法來測定代謝物的溶藻率.

熱穩(wěn)定性:將代謝物于90℃熱激15min,同樣以未經處理的代謝物為空白為找,設立3個平行實驗,用上述方法來測定代謝物的溶藻率.

分子量大小:將 200μL代謝物移入分子截流量為 5kD的超濾離心管中,以最大速率離心15min.將濾出液和截流液同時進行固體溶藻試驗.

2 結果

2.1 溶藻細菌的分離

從采集到的水樣里分離出 10多種單菌落,分別進行液體溶藻試驗,從中挑選出一株溶藻效果最佳的菌株,將其暫時命名為JZ-1.

2.2 細菌生理生化及分子生物學鑒定

菌株JZ-1在MB瓊脂培養(yǎng)基上的菌落呈圓形,表面光滑,不透明.革蘭氏陰性菌,無芽孢,能夠水解淀粉.具體生理生化結果如表1所示.

PCR擴增產物的長度為1372bp,用Blast程序對JZ-1的16S rDNA序列和GenBank中已登陸的16S rDNA序列進行核苷酸序列同源性比較,結果發(fā)現(xiàn),與多株交替單胞菌的同源性極高,再結合生理生化指標可以推斷出,實驗菌株屬于交替單胞屬(Alteromonas).

表1 菌株JZ-1的生理生化特征Table 1 The physiological characteristics of strain JZ-1

2.3 液體溶藻試驗

細菌培養(yǎng)液對中肋骨條藻生長影響的情況如圖1所示,對照組中的中肋骨條藻由對數(shù)生長期至穩(wěn)定期過渡,完整的藻細胞數(shù)持續(xù)上升;與對照組相比,處理組的完整藻細胞數(shù)在整個培養(yǎng)期呈顯著下降現(xiàn)象.至第10d為止,細菌培養(yǎng)液的溶藻率高達95.67%.

圖1 細菌培養(yǎng)液對中肋骨條藻的影響Fig.1 The effects of bacterial culture against Skeletonema costatum

2.4 熒光顯微鏡下觀察藻細胞變化

在菌株JZ-1的培養(yǎng)液作用下,中肋骨條藻藻細胞發(fā)生了一系列的改變(圖2).圖2a顯示的是正常情況下健康的中肋骨條藻細胞形態(tài):具有完整的細胞膜,且膜內物質齊全無損壞,在熒光顯微鏡下顏色鮮明,呈現(xiàn)特定的形狀.8h后,有些細胞依然保持完整的狀態(tài),但有些細胞開始發(fā)生變化(圖2b):膜內物質開始改變,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出顏色不鮮明,并有些渾濁的狀態(tài).16h后,絕大多數(shù)藻細胞的形態(tài)都已改變,膜內物質更加渾濁(圖2c).圖2d描述的是24h后的藻細胞形態(tài),這時不但膜內物質渾濁,而且細胞膜開始破裂,致使胞內物質外漏,藻細胞徹底死亡.

圖2 熒光顯微鏡下菌株JZ-1對中肋骨條藻藻細胞形態(tài)的作用觀察Fig.2 The Fluorescence microscopic observations of S. costatum in cultures with strain JZ-1

2.5 溶藻機理的探討

圖3 不同處理方式下的JZ-1菌株對中肋骨條藻的影響Fig.3 The effects of strain JZ-1 treated with different methods against S. costatum

圖3所示的是菌株JZ-1經過不同方式處理后對中肋骨條藻藻細胞的溶解作用.在菌株經不同方式處理后的第 2d,對比空白對照,經過細菌培養(yǎng)液、上清液、細菌過濾液處理的中肋骨條藻的藻細胞數(shù)均已發(fā)生變化:空白對照的藻細胞數(shù)達到 17.6×105個/mL;而經細菌培養(yǎng)液的上清液和過濾液的作用后的中肋骨條藻的藻細胞數(shù)分別降至13.5×105個/mL,13×105個/mL和11.5×105個/mL.但經菌體沉淀作用下的藻細胞數(shù)也達到了17×105個/mL,與空白對照相比差異不顯著.在從第2d至第10d的培養(yǎng)期內,菌體沉淀處理的中肋骨條藻藻細胞數(shù)始終與空白對照的藻細胞呈現(xiàn)大致同樣的增長速率,而細菌培養(yǎng)液、上清液與過濾液作用下的中肋骨條藻藻細胞數(shù)一直呈現(xiàn)持續(xù)下降現(xiàn)象,且下降程度大致相同.

2.6 代謝物溶藻試驗

如圖4所示,菌株JZ-1的代謝物的溶藻效率與其所處的細胞生長周期有一定的關系.在細菌細胞生長的遲緩期內,代謝物對中肋骨條藻的藻細胞沒有溶解作用.而從第 2d開始,當菌株細胞處于對數(shù)生長期初始階段時,這時所提出來的代謝物表現(xiàn)出一定的溶藻作用,而隨著菌株細胞個數(shù)的增加,代謝物的溶藻率也隨之提高,直至第3d,菌株由對數(shù)生長期向穩(wěn)定期過渡的時刻,代謝物的溶藻效率達到最大 76.4%.而隨著菌株進入穩(wěn)定期,代謝物的溶藻率卻隨之下降.

圖4 菌株JZ-1的代謝物的溶藻效率與細胞生長周期的關系Fig.4 The algicidal rates of metabolites extracted at different growing phase

2.7 代謝物性質的初步研究

根據(jù)圖4所示,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3d后的藻液所提出的代謝物的溶藻率最高,所以用此時提出的代謝物來進行下面試驗.

酸堿適應性:經過 0.1mol/L的 HCl和0.1mol/L NaOH 溶液處理后的代謝物的溶藻率對比未經任何處理的代謝物的溶藻率發(fā)生顯著變化(圖5).經過0.1mol/L的HCl溶液處理的代謝物的溶藻率降低至 11.2%,對比空白對照降低了65.6%.而經過 0.1mol/L NaOH 溶液處理后的代謝物沒有表現(xiàn)出任何溶藻作用.

熱穩(wěn)定性:將代謝物于90℃熱激15min,以除去其中在高溫下變性的物質,剩下的物質具有熱穩(wěn)定性.用濾紙片法同時測定經過高溫和沒有經過高溫處理的代謝物的溶藻率,發(fā)現(xiàn)沒有經過高溫處理的代謝物的溶藻率達到 76.8%,而經過高溫處理的代謝物的溶藻率也高達 74.8%,對比空白對照沒有顯著差異.

圖5 酸堿處理后的代謝物的溶藻率Fig.5 The algicidal activities of metabolite with and without acid and alkaline

分子量大小:分子截流量為5kD的超濾離心管將所提出的代謝物分離成兩部分,一部分物質的分子量＞5kD,另一部分物質的分子量＜5kD.根據(jù)固體溶藻試驗發(fā)現(xiàn),分子量＞5kD的那部分物質沒有溶藻現(xiàn)象,而在添加分子量＜5kD的物質的濾紙片周圍有明顯的大范圍抑藻圈,說明菌株JZ-1的溶藻活性物質分子量＜5kD.

3 討論

近年來,許多溶藻細菌[19-23]從不同的水源中被分離出來,而且關于研究中肋骨條藻爆發(fā)的機理和對環(huán)境產生危害的文章不少,但目前關于抑制中肋骨條藻生長的溶藻細菌的報道卻并不多見[24].本實驗室從膠州灣分離了幾株溶藻細菌,并選取了其中溶藻效果最佳的菌株JZ-1作為重點研究對象.根據(jù)生理生化試驗和16S rDNA序列分析鑒定得出JZ-1菌株屬于交替單胞菌屬的結論.根據(jù)報道,Shinya等[25]從東京一個富營養(yǎng)化池塘中分離出一株命名為X82145的交替單胞菌菌株;彭超等[26]也從武漢一個池塘出分離出一株對銅綠微囊藻有顯著溶解效果的溶藻細菌,此菌株亦屬于交替單胞菌屬.由此可見,交替單胞桿菌在抑制有害藻類爆發(fā)過程中有著重要的作用.

菌株JZ-1對實驗中所用的中肋骨條藻有著明顯的溶解作用,能夠有效地破壞中肋骨條藻細胞的內部結構和藻細胞膜的完整性,使得胞內物質流出,致使藻細胞破裂死亡.溶藻細菌抑藻大體是通過直接溶藻和分泌活性物質間接溶藻兩種方式[15,20].為了弄清楚 JZ-1菌株的溶藻方式,對細菌及其培養(yǎng)液進行離心、過濾等處理,并分別將各種處理進行溶藻試驗.結果發(fā)現(xiàn),菌株 JZ-1能夠溶解中肋骨條藻,但這種溶解作用發(fā)生在細菌培養(yǎng)液的上清液和0.2μm的過濾液中,而細菌的菌體對中肋骨條藻無任何影響.這些結果表示菌株JZ-1是通過分泌有效的活性物質來顯示溶藻活性的,其溶藻方式屬于間接溶藻方式.

為了進一步驗證上述結論,利用離子交換樹脂來提取細菌的分泌代謝物,并結合細菌生長的不同階段,采用濾紙片法來進行代謝物的固體溶藻試驗.結果發(fā)現(xiàn),菌株JZ-1在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期所產生的代謝物對中肋骨條藻的生長都產生一定的抑制作用;而其中在菌株由對數(shù)生長期向穩(wěn)定期過渡的時刻,代謝物的溶藻效率達到最大.

針對代謝物的性質,做了3項測試:酸處理后的代謝物的溶藻率比空白對照降低了 65.6%,而堿處理后的代謝物沒有表現(xiàn)出任何溶藻作用.這表示此代謝物有一定的耐酸性,但卻不耐堿;熱激后的代謝物仍然對中肋骨條藻有抑制作用,且溶藻率對比空白對照沒有顯著差異表明此代謝物具有熱穩(wěn)定性;分子截流量為5kD的超濾離心管將所提出的代謝物分離成兩部分,在分子量＜5kD的物質的濾紙片周圍有明顯的大范圍抑藻圈,說明菌株JZ-1的溶藻活性物質分子量＜5kD.

4 結論

4.1 菌株 JZ-1對中肋骨條藻有很好的溶解效果, 按10%的體積比進行溶藻試驗,發(fā)現(xiàn)10d內,細菌培養(yǎng)液的溶藻率高達95.67%.菌株破壞藻細胞的內部結構和藻細胞膜的完整性, 使得胞內物質流出,致使藻細胞破裂死亡.

4.2 菌株 JZ-1通過分泌代謝物進行溶藻,屬于間接溶藻.

4.3 當菌株 JZ-1由對數(shù)生長期向穩(wěn)定期過渡時,代謝物的溶藻效果最好.

4.4 菌株 JZ-1的代謝物具有一定的耐酸性,但卻不耐堿;具有熱穩(wěn)定性;分子量＜5kD.

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Lysis effect and mechanisum of one bacterial strain on Skeletonema costatum.

WANG Hui, LIU Ling, NIU Dan-dan, LIU Zhao-pu*(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Jiangsu Province, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China). China Environmental Science, 2011,31(6)：971～977

A strain of marine algae-lysing bacterium designated as JZ-1 was isolated from Jiaozhou Bay, China. Strain JZ-1 showed highly homology with Alteromonas sp. on the basis of morphological and biochemical characteristics and16S rDNA sequence analysis. Strain JZ-1 showed significant algicidal activity against Skeletonema costatum, it broke the materials structures in membrane and membrane integrity, and the materials leak through membrane to make the cells die. In addition, algicidal activity against S. costatum was detected in the filtrate and after filter through 0.2 μm syringe filter, not in the cells. Strain JZ-1 effects S. costatum by releasing certain algicidal substances, and this point was also confirmed by paper disk method. The metabolite had the highest algicidal activity at this moment when the bacterium transited to stationary phase from logarithmic growth phase. We tested some characteristics of the metabolite and the results were as follows: the molecular weight of metabolite was＜5kD; the metabolite had certain acid tolerance but no alkali tolerance; the metabolite had thermal stability.

water bloom；Skeletonema costatum；algae-lysing bacterium；algicidal mode

X172

A

1000-6923(2011)06-0971-07

2010-10-07

國家“十二五”科技支撐計劃(2011BAD13B09);國家自然科學基金資助項目(30600086)

* 責任作者, 教授, sea@njau.edu.cn

汪 輝(1985-),女,山東煙臺人,南京農業(yè)大學江蘇省海洋生物學重點實驗室博士研究生,主要從事微生物和藻類的環(huán)境生物學研究工作.發(fā)表論文6篇.