一株高產(chǎn)靈菌紅素粘質(zhì)沙雷氏菌的篩選與鑒定*

韋 鳳， 蔣冬花， 蔡琪敏， 宋迤明

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

靈菌紅素是一類天然紅色素家族的總稱，是由多種放線菌和細(xì)菌產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物．1929年Amako等在研究沙雷氏菌(Serratia)生長時發(fā)現(xiàn)，并由Harashima等在1960年首次分離得到此類物質(zhì)［1-2］．隨后，對該類物質(zhì)的性質(zhì)及生物活性的研究一直倍受相關(guān)研究者的關(guān)注．隨著研究的不斷深入，它的許多生物學(xué)活性被人們所認(rèn)識，包括抗細(xì)菌、抗瘧疾、抗真菌和抗原生動物的活性［3-5］．但人們最感興趣的是此物質(zhì)所具有的免疫抑制活性和引起腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［6-8］．

目前國內(nèi)相關(guān)研究集中于靈菌紅素生產(chǎn)工藝的研究，著重于高產(chǎn)菌種的獲得和生產(chǎn)工藝的優(yōu)化方面，以提高該天然色素的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本［9-11］．

本研究通過篩選自然生境中產(chǎn)色素菌株，從淡水魚體中分離得到一株高產(chǎn)紅色色素的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，編號為 Sm-128菌株．通過紫外吸收光譜及薄層色譜實驗，結(jié)合前人的研究結(jié)果，證實其所產(chǎn)色素為靈菌紅素．用甘油培養(yǎng)基培養(yǎng)Sm-128菌株，靈菌紅素粗品產(chǎn)量可達(dá)475 mg/L．Sm-128菌株生長快、周期短，生長條件粗放，生產(chǎn)色素能力強(qiáng)，性狀穩(wěn)定，可為工業(yè)化生產(chǎn)靈菌紅素提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源．

1 材料與方法

1．1 菌株來源

高產(chǎn)靈菌紅素沙雷氏菌株分離自浙江金華水庫淡水魚體，編號為Sm-128，由本實驗室保藏．

1．2 培養(yǎng)基

1)PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然 pH．

2)LB培養(yǎng)基:胰化蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7．0 ～7．2．

3)液體培養(yǎng)基(甘油蛋白胨培養(yǎng)基):蛋白胨5 g/L，甘油10 mL/L，自然 pH．

1．3 主要儀器與設(shè)備

紫外可見光分光光度計;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);循環(huán)水式多用真空泵;精密pH計;電子分析天平;電熱恒溫水浴鍋;顯微鏡(Leica，德國)等．

1．4 菌種分離純化和篩選

選取不同生境的材料，以PDA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基．從魚體等生境中篩選產(chǎn)生色素的菌株，方法(以魚體為例)如下:取浙江金華地區(qū)水庫淡水魚，取其內(nèi)臟切碎，以無菌水浸泡2 h，采用濃度梯度稀釋法，選擇合適濃度(10－2，10－3)的樣液，取 200 μL 涂布于 PDA 培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)，得紅色菌落．挑取紅色菌落，用連續(xù)劃線法純化，獲純菌株［12］128-130．

1．5 色素分析

1．5．1 紫外吸收光譜分析

通過測定色素分子對紫外/可見光的吸收，可以鑒定和定量分析大量的無機(jī)化合物和有機(jī)化合物．用藥匙從平板上刮取紅色菌苔，以無水乙醇作為浸提液，在研缽中充分研磨提取，收集融入色素的無水乙醇溶液，反復(fù)提取直到無水乙醇液不變色．將收集的無水乙醇溶液進(jìn)一步離心，得上清液，在紫外分光光度計下測定并繪制上清液的吸收光譜圖［13］．

1．5．2 薄層色譜分析

薄層色析法(TLC)是高效的色譜分離和高靈敏度的檢出少量物質(zhì)的一種實驗技術(shù)，也是判斷樣品純度的有效、簡單、快捷的方法．靈菌紅素提取常用的溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯及石油醚等，這些溶劑各具優(yōu)缺點．結(jié)合文獻(xiàn)［14］，最終選定展開劑為:V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶1．根據(jù)色素在色譜板上的分離效果及Rf值，再結(jié)合文獻(xiàn)，判斷色素的性質(zhì)．

1．5．3 產(chǎn)量分析

從活化的LB培養(yǎng)基上挑取約2環(huán)菌種接入培養(yǎng)液中，28℃，150 r/min培養(yǎng)12 h，再以3%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，在28℃，150 r/min培養(yǎng)24 h，可得含靈菌紅素的菌體，并有少量目的產(chǎn)物在培養(yǎng)液中．

發(fā)酵液以10 000 r/min離心15 min，并重復(fù)洗滌3次后得菌體和培養(yǎng)液．菌體直接用無水乙醇作為浸提液，輔以超聲波破碎進(jìn)行色素浸提，離心得上清液，反復(fù)多次直至菌體無顏色．收集上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得色素粗品，稱量，計算產(chǎn)量．

1．6 菌種鑒定

1．6．1 形態(tài)觀察

純化后的菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)2 d，取菌體先用簡單染色法和革蘭氏染色法染色，再用顯微鏡觀察拍照．

1．6．2 生理生化特征分析

菌株用LB培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)連續(xù)觀察5 d，進(jìn)行糖發(fā)酵、氧化酶、觸酶、尿素酶和H2S、甲基紅等實驗［12］220-225．

1．6．3 16S rDNA 基因序列分析

菌株基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)［15］的方法．利用細(xì)菌的16S rDNA通用正反向引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，以基因組 DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增．PCR程序為:98℃5 min，95 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個循環(huán)，延伸8 min．PCR擴(kuò)增用Taq酶，產(chǎn)物連入克隆載體pUCm-T后，由上海生物工程技術(shù)公司完成測序．

1．6．4 同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用BLAST程序?qū)ふ遗c目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，然后從GenBank基因序列數(shù)據(jù)庫中提取近緣菌株的16S rDNA基因序列，與測定的序列共同用Clustal X程序校準(zhǔn)排齊進(jìn)行多序列比較后，用MEGA4軟件以鄰接法(Neighbor-Joining法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．

2 結(jié)果與分析

2．1 產(chǎn)色素菌株的分離、純化和初篩

從自然界不同生境中篩選產(chǎn)色素的菌株，經(jīng)分離、純化，共獲得16株產(chǎn)不同色素的菌株．其中:產(chǎn)紅色色素的菌株9株(見圖1(a)，(c)和(f));產(chǎn)黃色色素的菌株4株(見圖1(b)和(e));產(chǎn)粉色色素的菌株2株(見圖1(d));產(chǎn)紫色色素的菌株1株．根據(jù)傳統(tǒng)分類方法觀察菌落、菌體特征，16株菌株中包括8株細(xì)菌、3株放線菌和5株真菌．部分菌株的菌落如圖1所示．

圖1 部分產(chǎn)色素菌株的菌落

2．2 產(chǎn)靈菌紅素菌株的復(fù)篩

靈菌紅素為一類紅色天然色素．從初篩結(jié)果可以看出，篩選出的16株產(chǎn)色素菌株中有9株產(chǎn)紅色色素，故對這9株菌株進(jìn)行復(fù)篩．靈菌紅素紫外光譜吸收峰在535 nm處［14］，采用紫外吸收光譜法對9株菌株所產(chǎn)色素進(jìn)行掃描檢測，最終獲得1株符合靈菌紅素吸收光譜(見圖2(a))的菌株．該菌株分離篩選自浙江金華淡水魚體，編號為Sm-128．

2．3 Sm-128菌株產(chǎn)色素的分析

2．3．1 紫外吸收光譜分析

Sm-128菌株產(chǎn)色素的紫外可見光吸收光譜見圖2(a)．以無水乙醇作為浸提液所得色素在535 nm處有明顯的吸收峰，說明該色素的分子結(jié)構(gòu)具有很大的共軛體系，可能有很多共軛雙鍵、苯環(huán)或類似苯環(huán)的共軛結(jié)構(gòu)，或含雜原子的雜環(huán)．從相關(guān)資料已知靈菌紅素的最大吸收波長為535 nm，其分子結(jié)構(gòu)中含有3個吡咯環(huán)［13］．Sm-128菌株所產(chǎn)色素的紫外可見光吸收光譜圖與文獻(xiàn)報道的靈菌紅素的紫外吸收譜圖一致．

2．3．2 薄層色譜分析

圖2 Sm-128菌株產(chǎn)色素(無水乙醇浸提)的分析

實驗結(jié)果表明，所選展開系統(tǒng)(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶1)對Sm-128菌株所產(chǎn)色素有較好的分離效果．在此展開系統(tǒng)下得到一紅色清晰斑點，其比移值Rf=0．60(見圖2(b))，與文獻(xiàn)報道靈菌紅素的結(jié)果一致．紫外吸收光譜及薄層色譜分析結(jié)果均與已有文獻(xiàn)［14］的結(jié)果一致，故可判斷該菌株所產(chǎn)色素即為靈菌紅素．

2．3．3 色素產(chǎn)量測定

Sm-128菌株生長迅速，生長條件粗放，在甘油培養(yǎng)基上經(jīng)過種子擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵3 d后，培養(yǎng)液色澤鮮艷，菌體粘稠．采用上述分離提取方法測得菌體生物量為3 g/L，色素產(chǎn)量達(dá)475 mg/L．

2．4 Sm-128菌株的鑒定

2．4．1 形態(tài)特征

Sm-128菌株在LB培養(yǎng)基上呈紅色，隨培養(yǎng)時間的延長顏色逐漸加深，生長迅速，12 h后菌落為圓型，表面隆起，光滑粘稠，易挑取(見圖3(a))，有輕微異味．在不同的培養(yǎng)基上，其生長狀態(tài)、顏色有所差異．

Sm-128菌株在顯微鏡下觀察為球形或短桿狀，長度1．0 ～1．2μm，寬度0．9 ～1．0 μm，革蘭氏染色陰性，無芽孢，無運動(見圖3(b))．

圖3 Sm-128菌株的形態(tài)特征

2．4．2 生理生化特征

Sm-128菌株革蘭氏染色呈陰性，兼性好氧;二乙酰試驗(V-P試驗)和過氧化氫酶反應(yīng)陽性，甲基紅(MR)試驗、氧化酶和苯丙氨酸反應(yīng)陰性;能利用蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露醇和阿拉伯糖產(chǎn)酸，不能利用乳糖產(chǎn)酸;能還原硝酸鹽;利用檸檬酸鹽可使明膠水解;不能在三糖鐵(TSI)瓊脂實驗中產(chǎn)生H2S．

2．4．3 分子生物學(xué)鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育樹

Sm-128菌株基因組DNA提取結(jié)果見圖4．采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長度為1 503 bp的基因，序列測定委托上海生物工程技術(shù)公司完成．該基因序列已在GenBank注冊(HQ834310)．

將Sm-128菌株的16S rDNA基因序列用BLAST進(jìn)行相似性比較后發(fā)現(xiàn)，其與沙雷氏菌屬內(nèi)種的同源性最高．然后，將Sm-128菌株的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的沙雷氏菌屬內(nèi)近緣菌株進(jìn)行多序列比較后，用MEGA4以Neighbor-Joining法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖5)，與粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)菌株的同源性達(dá)99．2%．結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征最終鑒定該Sm-128菌株屬于沙雷氏菌屬(Serratia)的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)．

圖4 Sm-128菌株基因組DNA和16S rDNA電泳分析圖

圖5 基于16S rDNA基因序列建立的沙雷氏菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

在從自然界不同生境中篩選產(chǎn)色素菌株的過程中獲得了16株顏色各異、具有代表性的微生物菌株，其中包含1株在淡水魚體內(nèi)分離得到的產(chǎn)紅色色素、生長迅速、條件粗放的Sm-128菌株．

本實驗對Sm-128菌株首先通過常規(guī)的菌落外觀特征、顯微鏡下特征和生理生化實驗［16］進(jìn)行了初步鑒定，進(jìn)一步通過16S rDNA序列分析得到其與粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)同源性為99．2%，最終鑒定該菌為粘質(zhì)沙雷氏菌．該菌株的16S rDNA基因序列已在GenBank注冊(HQ834310)．

粘質(zhì)沙雷氏菌是生產(chǎn)靈菌紅素的主要菌株，本實驗所述Sm-128菌株所產(chǎn)色素表觀可見為紅色色素，紫外吸收光譜和薄層色譜分析所得結(jié)論均與已有文獻(xiàn)結(jié)論相一致，故判斷Sm-128菌株所產(chǎn)色素即為靈菌紅素．該菌株在甘油培養(yǎng)基上培養(yǎng)的生物量可達(dá)3 g/L，色素粗品產(chǎn)量達(dá)475 mg/L．此產(chǎn)量為未經(jīng)過條件優(yōu)化的結(jié)果，且提取工藝尚待進(jìn)一步優(yōu)化．

靈菌紅素是一大類紅色色素的總稱，該實驗中目前所得結(jié)果尚未精確到色素的具體組分，將通過后續(xù)實驗分析其不同的組分與結(jié)構(gòu)．

［1］Shieh W Y，Chen Yiwen，Chaw S M，et al．A red，facultatively anaerobic，marine bacterium isolated from sea water［J］．Int J Syst Evol Microbiol，2003，53(2):479-484．

［2］Pandey R，Chander R，Sainis K B．A novel prodigiosin-like immunosuppressant from an alkalophilic Micrococcus sp．［J］．Int Immunopharmacology，2003，3(2):159-167．

［3］Giri A V，Anandkumar N，Muthukumaran G，et al．A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil［J］．Bio MedCentral Microbiol，2004，4(1):11-21．

［4］Nakashima T，Kato Y，Yamaguchi K，et al．Evaluation of the anti-trichophyton activity of a prodigiosin analogue produced by γ-proteobacterium，using stratum corneum epidermis of the Yucatan micropig［J］．J Infection Chemotherapy，2005，11(3):123-128．

［5］Song Cang，Sanada M，Johdo O，et al．High production of prodigiosin by Serratia marcescens grown on ethanol［J］．Biotech Lett，2000，22(22):1761-1765．

［6］Montaner B，Perez T R．The cytotoxic prodigiosin induces phosphorylation of p38-MAPK but not of SAPK/JNK［J］．Toxicol Lett，2002，129(11):93-98．

［7］Songia S，Mortellaro A，Tavema S，et al．Characterization of the new immunosuppressive drug undecylprodigiosin in human lymphocytes:retinoblastoma protein，cyclin-dependent kinase-2，and cyclin-dependent kinase-4 as molecular targets［J］．J Immunol，1997，158(8):3987-3995．

［8］Yamamoto D，Uemura Y，Tanaka K，et al．Cycloprodigiosin hydrochloride H+/Cl－symporter induces apoptosis and differentiation in HL-60 cells［J］．Int J Cancer，2000，88(1):121-128．

［9］王學(xué)東．靈菌紅素發(fā)酵與分離過程優(yōu)化及其誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用的研究［D］．上海:華東理工大學(xué)，2004．

［10］Tao Jinli，Wang Xuedong，Shen Yaling，et al．Strategy for the improvement of prodigiosin production by a Serratia marcescens mutant through fed-batch fermentation［J］．World J Microbiol Biotechnol，2005，21(6/7):969-972．

［11］Wei Yuhong，Yu Wanju，Chen Weichuan．Enhanced undecylprodigiosin production from Serratia marcescens SS-1 by medium formulation and amino-acid supplementation［J］．J Biosci Bioeng，2005，100(4):466-471．

［12］周德慶．微生物學(xué)實驗教程［M］．2版．北京:高等教育出版社，2009．

［13］Lewis S M，Corpe W A．Prodigiosin producing bacteria from marine sources［J］．App Micro biol，1963，12(1):13-17．

［14］李厚金，蔡創(chuàng)華，周毅頻，等．大亞灣海洋細(xì)菌Pseudomonas sp．中的紅色素［J］．中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2003，42(3):102-104．

［15］曹亞．實用分子生物學(xué)操作指南［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2003:39-40．

［16］布坎南 R E，吉本斯 N E．伯杰細(xì)菌鑒定手冊［M］．8版．中國科學(xué)院微生物研究所，譯．北京:科學(xué)出版社，1984．