脈沖場(chǎng)凝膠電泳在沙門(mén)菌鑒定中的應(yīng)用

樓許柏，馬章林

（深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518108）

·檢驗(yàn)與臨床·

脈沖場(chǎng)凝膠電泳在沙門(mén)菌鑒定中的應(yīng)用

樓許柏，馬章林

（深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518108）

目的 探討脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）在沙門(mén)菌分型鑒定中的應(yīng)用價(jià)值。方法 用PFGE方法對(duì)一起食物中毒分離出的68株腸炎沙門(mén)菌菌株進(jìn)行分子分型。結(jié)果 180份標(biāo)本經(jīng)傳統(tǒng)生化和血清分型鑒定出的68株腸炎沙門(mén)菌，通過(guò)PFGE分型后，均產(chǎn)生14條電泳條帶，且分子量大小一致。通過(guò)BioNumerics軟件的數(shù)據(jù)化處理分析，得到聚類(lèi)關(guān)系樹(shù)，68株腸炎沙門(mén)菌指紋圖譜的相似性為100%，與H9812的相似性為65.65%。結(jié)論 PFGE是沙門(mén)菌分型鑒定的有效手段，可用于細(xì)菌性食物中毒傳染源的追蹤。

脈沖場(chǎng)凝膠電泳；沙門(mén)菌；鑒定

我國(guó)發(fā)生的食物中毒中細(xì)菌性食物中毒占30%～90%，其中又以沙門(mén)菌食物中毒最常見(jiàn)。由于沙門(mén)菌抗原種類(lèi)多，常規(guī)鑒定方法比較困難。近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、多位點(diǎn)酶電泳、質(zhì)粒酶切圖譜分析等在食物中毒中的應(yīng)用日益廣泛，使得追蹤傳染源、細(xì)菌鑒定、耐藥基因的檢測(cè)等變得更加快速和準(zhǔn)確、簡(jiǎn)潔和快速[1-2]。脈沖電場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是20世紀(jì)80年代初出現(xiàn)的一種分離大分子DNA的方法，可以用來(lái)分離大小從10kb到10Mb的DNA分子。近年來(lái)，核酸脈沖電泳場(chǎng)技術(shù)日益成熟，加上采用酶切位點(diǎn)少的限制性內(nèi)切酶，可分析菌株之間的關(guān)系，逐漸形成一套操作簡(jiǎn)單、分辨率高、標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)性強(qiáng)的細(xì)菌分子分型方法，在院內(nèi)感染和傳染病的流行病學(xué)調(diào)查中起到越來(lái)越重要的作用[3-4]。本項(xiàng)目采用PFGE對(duì)我市發(fā)生的一起食物中毒的分離菌株進(jìn)行分型，以期在分子水平上追蹤傳染源，有效控制食物中毒。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 2010年10月我市發(fā)生一起職工食堂食物中毒，共采集包括剩余食品，患者的肛拭子、糞便、嘔吐物等在內(nèi)的標(biāo)本180份。按《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)》方法進(jìn)行致病菌的分離和鑒定，共分離出腸炎沙門(mén)菌68株，菌株進(jìn)行分批鑒定和低溫保存(-80℃，15%甘油)。分子量標(biāo)準(zhǔn)菌株為沙門(mén)菌Braenderup血清型全球參考菌株H9812，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 主要儀器和試劑 脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)、恒溫水浴搖床、紫外蛋白分光光度計(jì)。XbaⅠ酶（英國(guó)Biolabs公司），蛋白酶K（Sigma公司），瓊脂糖（基因公司），TEN緩沖液，0.5μg/ml溴化乙錠（EB），電泳用水經(jīng)微孔過(guò)濾系統(tǒng)純化。

1.3 方法 采用相同的樣品處理方法、相同的菌液濃度、相同的酶切時(shí)間和相同的電泳條件對(duì)分離出的68株腸炎沙門(mén)菌菌株進(jìn)行分子分型。每次PFGE分型可分析13株菌株，故共作6次PFGE分型。

1.3.1 膠塊制備 用普通瓊脂平板分離待檢菌和H9812，37℃過(guò)夜，用無(wú)菌棉簽刮取適量細(xì)菌，懸浮于2ml細(xì)胞懸浮液中，波長(zhǎng)610nm處調(diào)節(jié)OD值為1.4左右。取200μl細(xì)菌懸液加入1.5ml離心管中，依次加入10μl蛋白酶K溶液(儲(chǔ)存液濃度為20mg/ml)、200μl熔化的1%Seakem Gold、1%SDS，室溫下混勻后立即倒入凝膠塊模具中，靜置20min讓瓊脂糖固化。

1.3.2 蛋白消化 在50ml的聚丙烯螺口蓋管上作好標(biāo)記。每管中加入5ml細(xì)胞裂解液，將膠塊轉(zhuǎn)入相應(yīng)標(biāo)記的管中。54℃水浴搖床（轉(zhuǎn)速150～175r/min）中孵育2h，用純水洗滌模塊2次，TE緩沖液洗滌3次，每次15min，50℃慢速振蕩洗滌。

1.3.3 酶切 將模塊切成2mm薄片，浸入含XbaⅠ酶50U的200μl酶切體系中，37℃靜置3h。

1.3.4 上樣 棄去溶液，每管加入0.5×TBE電泳緩沖液200μl，室溫放置5～10min。將每株菌的模塊薄片直接粘在兩邊梳子齒上。每塊膠放置13個(gè)樣品和2個(gè)H9812。把梳子放入膠槽，從膠槽的下部中央緩慢倒入在55℃～60℃平衡的100ml熔化的1%瓊脂糖，室溫下凝固30min；小心移去樣品梳，去除擋板。

1.3.5 電泳 將膠塊放入電泳槽，加入2000ml的0.5×TBE，剛好覆蓋膠的表面即可。電壓6V/cm，電泳溫度14℃，脈沖時(shí)間2.2～63.8s，線性轉(zhuǎn)換，電泳時(shí)間18h。

1.3.6 染色 電泳結(jié)束后，將凝膠放入0.5μg/ml溴化乙錠染色液中，染色30min；再放入去離子水中，搖床上脫色90min。

1.3.7 讀膠及數(shù)據(jù)分析 用Gel Doc 2000拍攝圖像，轉(zhuǎn)換成*.tif文件后，用BioNumerics數(shù)據(jù)庫(kù)軟件對(duì)電泳圖像進(jìn)行分析，得出聚類(lèi)樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果

2.1 菌株的PFGE分型結(jié)果 180份標(biāo)本經(jīng)傳統(tǒng)生化和血清分型鑒定出的68株腸炎沙門(mén)菌，通過(guò)PFGE分型后，均產(chǎn)生14條電泳條帶，且分子量大小一致，片段大小為20～1000kb，6次PFGE實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好（圖1）。

圖1 腸炎沙門(mén)菌的電泳結(jié)果

2.2 同源性分析結(jié)果 通過(guò)BioNumerics軟件的數(shù)據(jù)化處理分析，得到聚類(lèi)關(guān)系樹(shù)，68株腸炎沙門(mén)菌指紋圖譜的相似性均完全一致，達(dá)到100%，與H9812的相似性為65.65%。

3 討論

PFGE技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分子分型，美國(guó)、加拿大等國(guó)家已建立了以PFGE為核心技術(shù)的細(xì)菌分子分型國(guó)家電子網(wǎng)絡(luò)(PulseNet)，便于各實(shí)驗(yàn)室之間通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行DNA圖譜的快速傳遞與比較，對(duì)暴發(fā)疫情或散發(fā)病例進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和分析，48h之內(nèi)便可完成，因而是有效的早期預(yù)警的監(jiān)測(cè)手段。PulseNet已經(jīng)在數(shù)起大腸桿菌O157、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌暴發(fā)事件中的傳染源、傳播途徑和流行范圍的確定等方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用[5-6]。

本項(xiàng)目將PFGE技術(shù)用于食物中毒病原菌的鑒定分型，確定了引起沙門(mén)菌食物中毒暴發(fā)的污染源，在疫情的控制方面發(fā)揮了重要作用。180份標(biāo)本經(jīng)傳統(tǒng)生化和血清分型鑒定出的68株腸炎沙門(mén)菌，通過(guò)PFGE分型后，均產(chǎn)生14條電泳條帶，且分子量大小一致，分離的腸炎沙門(mén)菌具有完全相同的PFGE圖譜，表明是同一克隆的菌株造成了這次食物中毒的暴發(fā)。

因?yàn)榧?xì)菌的具有高度的變異性，當(dāng)判斷是否是同一菌株造成的污染時(shí)，允許有一定的變異存在。有學(xué)者認(rèn)為PFGE具有85%以上相同條帶的菌株可認(rèn)定是相同的菌株，50%以上的條帶不相同時(shí)，可認(rèn)定為流行病學(xué)上不相關(guān)[7-8]。本項(xiàng)目所有分離的菌株的DNA條帶具有100%的相似性，表明是相同來(lái)源的菌株。

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Application of pulsed-field gel electrophoresis in the identification of salmonella.

LOU Xu-bai,MA Zhang-lin.Department of Clinical Laboratory,Shizi Division of People's Hospital of Baoan District,Shenzhen 518108,Guangdong,CHINA

Objective To investigate the value of pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)in the typing identification of salmonella.Methods PFGE method was used to 68salmonella strains molecular typing identification isolated from food poisoning.Results 68strains of salmonella enteritidis identified by traditional biochemical and the serotyping from 180specimens,after typing by PFGE,14electrophoretic bands were produced,and had the same molecular weight.The data was analyzed by BioNumerics software,clustering trees were obtained.The similarity of fingerprints was 100%in 68salmonella enteritidis,65.65%similarity with the H9812.Conclusion PFGE is an effective means in the typing identification of Salmonella,and can be used to trace the source of infection in bacterial food poisoning.

Pulsed-field gel electrophoresis;Salmonella;Identification

R378

A

1003—6350（2011）15—111—02

樓許柏（1952—），男，浙江省諸暨市人，副主任技師，學(xué)士，研究方向：儀器分析。

2011-04-05）