間接比例法檢測結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗影響因素探討＊

曹鴻遠 王槐堂

湖北省咸寧市結(jié)核病防治所 437100

間接比例法檢測結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗影響因素探討＊

曹鴻遠 王槐堂

湖北省咸寧市結(jié)核病防治所 437100

目的：探討間接比例法檢測結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗的影響因素。方法：通過對我室2009、2010年兩次參加國家結(jié)核病參比室組織的結(jié)核桿菌藥物敏感試驗室間質(zhì)評的結(jié)果進行比較與分析,找出影響實驗成敗的關鍵因素包括含藥培養(yǎng)基配制的質(zhì)量控制、實驗過程的規(guī)范化、環(huán)境溫度的實時監(jiān)測、結(jié)果觀察及判斷等等,為以后的實驗提供技術支持。結(jié)果：2010年與國家結(jié)核病參比室的藥敏結(jié)果符合率比2009年有較大的提高。結(jié)論：培養(yǎng)基的質(zhì)量、培養(yǎng)的溫度和操作人員的技術嫻熟程度均會影響藥敏試驗結(jié)果。關鍵詞 間接比例法 結(jié)核桿菌 藥物敏感試驗 影響因素

結(jié)核桿菌藥物敏感試驗的結(jié)果準確與否是影響第五輪全球基金耐多藥控制項目病人發(fā)現(xiàn)及其治療方案制訂的關鍵因素。本室于2009年8月和2010年3月兩次參加了國家結(jié)核病參比實驗室組織的結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗室間質(zhì)評活動,完成了62株(每年31株)結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗的檢測工作?，F(xiàn)將檢測情況總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 檢測菌株均由國家參比室提供,由湖北省參比實驗室轉(zhuǎn)種后下發(fā)給本室培養(yǎng),第31株為標準結(jié)核分枝桿菌H 37Rv敏感株,用以檢測含藥培養(yǎng)基質(zhì)量。

1.2 藥敏培養(yǎng)基的制備 按湖北省參比實驗室的統(tǒng)一要求配制。含藥培養(yǎng)基分別為 INH/RFP/ SM/EMB,陽性對照培養(yǎng)基為改良羅氏培養(yǎng)基。對照培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基配制方法均按照WHO《結(jié)核病控制實驗室工作手冊(1998)》中的有關規(guī)定執(zhí)行[1]。2～8℃貯存,3個月內(nèi)使用。

1.3 實驗操作 用間接比例法,每份標本及每種藥均接種兩支菌量分別為10-2、10-4CFU/管[2]。2009年31株菌株分別于7月14日(10株)、19日(7株)、27日(12株)、31日(2株)四次接種,分別放置于36.5℃兩個培養(yǎng)箱內(nèi),其中在14、19、31日接種的19株菌株的培養(yǎng)箱溫控器于8月1日18點以后突然失靈,8月2日上午8時筆者觀察時箱內(nèi)溫度顯示45℃,維持時間小于14h,續(xù)將這19株菌株轉(zhuǎn)移至36.5℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),至4周觀察結(jié)果。2010年31株菌株,一次性接種放置于36.5℃培養(yǎng)至4周觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 陽性對照生長情況 2009年31株標本中,由于有19株標本受溫控器失靈導致的短期溫度升高的影響,因而各時間段接種的標本陽性對照的生長情況有一定差異：7月7日接種的12株(每株2管,以下同)陽性對照中有23管生長良好,其中一株-2濃度未生長,但-4濃度1+;溫控器失靈的培養(yǎng)箱內(nèi)的19株標本中,7月14日接種的10株標本,陽性對照生長的有8株計14管,兩株-4濃度對照管未生長;19日接種的7株標本中陽性對照生長的有2株(其中一株為 H 37Rv敏感株)中的-2濃度管,但只有幾個菌落,-4濃度管無菌落生長,31日的2例陽性對照無一生長。2010年的31株標本,陽性對照中有58管生長良好,一株-2濃度管未生長,但-4濃度管2+,3株-4濃度管未生長,H 37Rv敏感株陽性對照生長良好;兩種濃度陽性對照菌落生長融合未顯出明顯濃度差異3例。

2.2 污染情況 2009年檢測的標本中-2濃度管全部污染1例;2010年檢測的無污染。

2.3 計算耐藥百分比 若耐藥百分比＞1%則認為受試菌對該抗結(jié)核藥耐藥,≤1%則為敏感[2]。本文主要統(tǒng)計與國家參比室結(jié)果的符合率。由于2009年的31株標本陽性對照生長的只有22株,因此其藥敏結(jié)果的比較只能以22株來計算,與國家參比室的結(jié)果相比符合株數(shù)比依次為INH 18/22、RFP17/22、SM4/22、EMB 5/22;2010年 INH 29/31、RFP28/31、SM26/31、EMB 25/31。

3 討論

3.1 部分陽性對照未長 (1)溫度的影響。從以上結(jié)果觀察中可看出：在結(jié)核桿菌培養(yǎng)過程中,相對短期的45℃環(huán)境,對經(jīng)36.5℃環(huán)境培養(yǎng)時間在2周以內(nèi)的9株標本影響極大,陽性對照生長率為2/18,但對36.5℃環(huán)境培養(yǎng)時間超過2周的標本影響相對較小,陽性對照生長株數(shù)比為16/20。這可能因為結(jié)核分枝桿菌是慢生長菌,代期較長;此外細菌的初期生長有其一定的生長調(diào)整周期,這一時期內(nèi)受環(huán)境溫度影響較大。以后細菌進入對數(shù)生長期,短期的溫度略升,對細菌的生長繁殖影響相對較小。(2)菌落未磨勻、稀釋不均勻、接種環(huán)挑取了空泡等也是造成部分對照不生長的主要原因。

3.2 未顯出明顯濃度差異 配制1mg/m l濃度菌液時菌量過多,兩濃度陽性對照培養(yǎng)基的生長程度均在3+～4+。

3.3 污染 -2濃度全污染1例,且菌落生長特征相同,經(jīng)革蘭氏染色證實為真菌污染。本例低濃度培養(yǎng)管未見污染,接種環(huán)境污染應可排除,可能首先接種的陽性對照培養(yǎng)基在貯存過程中被污染但未被發(fā)現(xiàn),后仍經(jīng)依次接種導致本例整個-2濃度培養(yǎng)基被污染。

3.4 結(jié)果觀察與判斷的難點 通過這兩次測試,結(jié)合平時的實驗觀察,發(fā)現(xiàn)：(1)少數(shù)菌株無論是在陽性對照還是含藥培養(yǎng)基上在四周的報告期限內(nèi)菌落生長不明顯,延遲1～2周可獲明顯結(jié)果。此類菌株生長速度更為緩慢,但延長時間觀察是否會影響結(jié)果的準確性卻值得探討。(2)絕大多數(shù)耐藥菌株耐藥百分比均較大,但偶有臨床提示療效欠佳(治療3個月末仍菌陽)而藥物敏感實驗結(jié)果顯示利福平0＜耐藥百分比≤1%的病例,重復實驗結(jié)果仍然相同。此類標本用絕對濃度法檢測是否為RFP低濃度耐藥,高濃度敏感尚不得而知。但有文獻報道,比例法和絕對濃度法在檢測結(jié)核分枝桿菌對1NH、RFP和 EMB的藥物敏感性時差異有統(tǒng)計學意義[3]。

3.5 2009年陽性對照生長良好的20株標本SM、EMB全部耐藥,與國家參比室的結(jié)果相比符合株數(shù)比卻分別只有4/22,5/22。因同批H37Rv敏感株受溫度影響較大,其結(jié)果不能作為評價含藥培養(yǎng)基質(zhì)量的依據(jù),結(jié)合同時參加這兩次試驗的其他實驗室的結(jié)果,推測可能為含藥培養(yǎng)基的配制問題。

3.6 SM、EMB與國家參比室的結(jié)果相比仍未達到符合率90%的要求,其原因仍有待分析。

4 對策

根據(jù)參加結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗室間質(zhì)評結(jié)合本室平時結(jié)核桿菌培養(yǎng)和藥物敏感性試驗的經(jīng)驗,筆者認為提高結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗準確率要注重做好下列工作。

4.1 培養(yǎng)基的配制及保存 培養(yǎng)基的配制主要注意各藥物的質(zhì)量、稱量的準確性、稀釋比例的正確與否及滅菌的溫度和時間等;培養(yǎng)基應在2～8℃低溫保存且不超過3個月,不得暴露在紫外線下。

4.2 實驗過程的規(guī)范化 (1)做好實驗室環(huán)境及實驗器材的消毒滅菌工作。(2)防范交叉污染。批量測試時在磨菌、稀釋及接種過程中均有產(chǎn)生交叉污染的可能。特別是要防范粘有菌液的塑料接種環(huán)彈出試管外引起交叉污染和環(huán)境污染。(3)1mg/m l菌液的配制：首先挑取盡可能大范圍的菌落,以防漏掉可能的變異株;其次挑取菌落時不得雜有培養(yǎng)基,菌落要盡可能磨勻,并取適量生理鹽水沖洗磨菌棒及管壁后混勻放置,待未磨勻的粗大顆粒沉淀后取液體上部混懸液稀釋比濁,稀釋管與標準比濁管材質(zhì)及大小要盡可能一致,便于肉眼比濁。(4)接種菌液前先觀察培養(yǎng)基是否新鮮,有無污染,稀釋與接種時均要注意稀釋是否均勻,挑取菌液是否足量,有沒有挑空環(huán)或氣泡。用劃線法接種注意盡可能使菌液均勻分散于培養(yǎng)基斜面。

4.3 每天作好培養(yǎng)環(huán)境溫度的監(jiān)測 將培養(yǎng)箱的溫度控制在(36.5±1)℃。結(jié)核分枝桿菌復合群的最適生長溫度為35～37℃,而有些類型的分枝桿菌在25℃、30～33℃或45℃也可生長[4]。

4.4 結(jié)果觀察時兩濃度陽性對照管應顯示明顯的濃度梯度,以此作為判斷菌液稀釋比例正確與否在觀察結(jié)果時,無論是在這兩批次的測試中,還是在日常的藥敏檢測中也常見菌株生長速度不一的現(xiàn)象。有的菌株生長快速,在1周內(nèi)生長的多為非典型分枝桿菌,在PNB培養(yǎng)基中可生長,據(jù)此可與結(jié)核分枝桿菌復合群相鑒別[5],2008-2010年本室檢測出非典型分枝桿菌7例,其中痰標本5例,尿標本2例,菌落初次生長時間均小于7d。

[1] 端木宏瑾,屠德華,張培云,等.臨床技術操作規(guī)范〔M〕.北京：人民軍醫(yī)出版社,2004：32-34.

[2] 王隴德,劉劍君,姜世聞.結(jié)核病防治〔M〕.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社,2004：108-109.

[3] 武杰,桂曉紅,等.比例法與絕對濃度法檢測結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗的比較〔J〕.中華檢驗醫(yī)學雜志,2011,34：137-138.

[4] 謝惠安,陽國太,等.現(xiàn)代結(jié)核病學〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社,2000：99-103.

[5] 馬玙,朱莉貞,潘毓萱.結(jié)核病〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社, 2006：109-110.

The Proportion of Indirect Detection of Mycobacterium Tuberculosis Drug Susceptibility Testing of Factors

CAO Hongyuan,WANGHuaitang.TBControlCenterofXianningCity,HubeiProvince437100

Objective：To explore the influence of indirect proportion method in testing Mycobacterium tuberculosis.Methods：Mycobacterium tubercu losis d rug suscep tibility testing resultsw ere com pared and analyzed to identify the key fac tors of success or failure of experiments,including preparation of the quality of the drug-containing medium control, experimental process of standardization,real-timemonitoring of the ambient temperature,the results of observations and judgments,etc.Results：2010 national TB reference room with suscep tibility results consistent with a greater rate than the increase in 2009.Conclusion：The quality of themedium,culture temperature and skilled operators will affect the degree of suscep tibility test resu lts.

Indirect proportion method,Mycobacterium tuberculosis,Drug sensitivity test,Factors

R446.5

A

1001-7585(2011)10-1121-03

國家第五輪全球基金耐多藥結(jié)核病防治項目

2011-03-23

(編輯江山)

病例報告