甲磺酸伊馬替尼的耐藥機(jī)制及逆轉(zhuǎn)策略

吳榮娟(綜述)，馬旭東(審校)

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院血液科，福建漳州363000)

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一種發(fā)生在早期多能造血干細(xì)胞上的惡性骨髓增殖性疾病。95%以上的CML細(xì)胞中有特征性t(9;22)(q34;q11)，形成bcr/abl融合基因，其編碼的p210bcr/abl蛋白具有高酪氨酸激酶的活性，可導(dǎo)致自身酪氨酸殘基磷酸化及許多重要的底物蛋白磷酸化，使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，過度增殖和凋亡受阻。甲磺酸伊馬替尼是2-苯氨嘧啶的衍生物，是作用于bcr/abl酪氨酸激酶的抑制劑，它能競(jìng)爭(zhēng)性抑制ATP或底物與酪氨酸激酶催化中心結(jié)合，阻止酪氨酸激酶活化從而發(fā)揮靶向治療作用。

1 伊馬替尼的耐藥機(jī)制

隨著伊馬替尼治療時(shí)間的延長(zhǎng)，原發(fā)或繼發(fā)耐藥導(dǎo)致的治療失敗越來越多見，已嚴(yán)重制約了其臨床應(yīng)用。目前對(duì)于伊馬替尼的耐藥機(jī)制的主要觀點(diǎn)如下。

1．1 bcr/abl融合基因的點(diǎn)突變 目前認(rèn)為，bcr/abl基因突變是甲磺酸伊馬替尼產(chǎn)生耐藥的常見機(jī)制。已檢測(cè)到的突變有100多種，可發(fā)生在ABL激酶的ATP結(jié)合環(huán)(P-環(huán))、激活環(huán)(A-環(huán))或在兩者之間的非催化區(qū)。點(diǎn)突變引起ABL激酶氨基酸改變，通過直接阻斷伊馬替尼與ABL激酶的結(jié)合或者妨礙ABL激酶失活構(gòu)象的形成而干擾藥物與靶位點(diǎn)的結(jié)合，最終導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。Kim［1］及 O'Hare等［2］對(duì) 70例伊馬替尼耐藥的CML患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)81個(gè)突變點(diǎn)，9例為多位點(diǎn)突變。其中，T315I位點(diǎn)(蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?突變率最高，其次為E255K、Y253H、G250E點(diǎn)突變，而且 Y253H、E225K、T315I和 F317L突變隨著CML疾病的進(jìn)展出現(xiàn)頻率增加。

1．2 bcr/abl基因擴(kuò)增及其表達(dá)增加 靶基因擴(kuò)增和表達(dá)增加是許多抗腫瘤藥物耐藥原因之一。Weisberg等［3］采用伊馬替尼藥物濃度遞增法誘導(dǎo)小鼠前B淋巴細(xì)胞(Ba/F3-p210)(p210bcr/abl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞)及K562細(xì)胞產(chǎn)生伊馬替尼耐藥，結(jié)果顯示Ba/F3-p210細(xì)胞耐藥機(jī)制為bcr/abl基因擴(kuò)增，mRNA及p210蛋白高表達(dá)。而相同方法誘導(dǎo)的K562耐藥細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)bcr/abl基因擴(kuò)增，而僅僅有2～3倍的p210蛋白表達(dá)增加。

1．3 P糖蛋白的作用 P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)基因MDR1編碼的一種跨膜糖蛋白，由1 280個(gè)氨基酸構(gòu)成，屬于典型的ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，能利用ATP水解釋放的能量主動(dòng)將疏水親脂性化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度低于殺傷濃度，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生 MDR。Thomas等［4］采用14C標(biāo)記伊馬替尼在P-gp陽性表達(dá)細(xì)胞系上證實(shí)伊馬替尼確實(shí)通過P-gp通道轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外。

1．4 白血病干細(xì)胞的影響 Holtz等［5］研究指出，CML的白血病干/祖細(xì)胞對(duì)伊馬替尼不敏感，伊馬替尼并不能有效抑制其增殖并誘導(dǎo)其凋亡。房佰俊等［6］和 Fang 等［7］在對(duì) bcr/abl+Flk1+CD31-CD34-細(xì)胞的研究中進(jìn)一步證明，伊馬替尼對(duì)分化成熟或相對(duì)成熟的白血病細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，但對(duì)CML的原始白血病干細(xì)胞則可能是部分、甚至是完全耐藥的。

1．5 蛋白酶體的參與 齊靜［8］在對(duì)K562及伊馬替尼耐藥株K562/G0l細(xì)胞進(jìn)行差異蛋白組學(xué)分析時(shí)，揭示出包括蛋白酶體在內(nèi)的10個(gè)蛋白與白血病伊馬替尼耐藥相關(guān)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了蛋白酶體確實(shí)參與了白血病細(xì)胞對(duì)伊馬替尼耐藥的發(fā)生，并闡明蛋白酶體通過增加IκB抑制因子的降解，促進(jìn)藥物作用下核因子κB的核轉(zhuǎn)位和活化以及加速伊馬替尼作用靶蛋白bcr/abl的更新，使白血病細(xì)胞對(duì)伊馬替尼產(chǎn)生耐藥。

1．6 其他蛋白酪氨酸激酶的作用 近來發(fā)現(xiàn)Src家族中的Lyn激酶能調(diào)節(jié)伊馬替尼治療CML的敏感性，并且在伊馬替尼治療失敗并未出現(xiàn)bcr/abl突變情況的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)持續(xù)的Lyn激酶活性。研究顯示，Lyn不僅影響CML疾病的進(jìn)程，而且在bcr/abl沒有突變的CML中能夠保持組成性活化而影響細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感性［9］。

1．7 其他耐藥機(jī)制 ①JAK激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)通路的作用。JAK/STAT是bcr/abl的眾多下游信號(hào)途徑之一。有研究發(fā)現(xiàn)［10］，JAK2抑制劑 AG490對(duì)伊馬替尼耐藥細(xì)胞32Dp210-T315I的抑制作用比伊馬替尼敏感細(xì)胞32Dp210更顯著，可能在耐藥細(xì)胞中JAK/STAT通路占主要地位。②蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)的異常表達(dá)。有研究表明，在許多惡性腫瘤如子宮內(nèi)膜癌、肝癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、濾泡狀甲狀腺癌、肺癌和白血病中，磷酸化AKT呈持續(xù)高度活化，而且AKT的異常表達(dá)與這些腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡以及對(duì)放化療產(chǎn)生的耐受性密切相關(guān)。

2 逆轉(zhuǎn)耐藥的策略

2．1 增加用藥量 研究顯示［11］，先前采用400 mg/d伊馬替尼治療產(chǎn)生血液學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)耐藥的患者接受800 mg/d伊馬替尼治療后，65%達(dá)完全血液學(xué)緩解，18%達(dá)完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解。先前未使用過伊馬替尼的慢性期患者使用800 mg/d伊馬替尼后有66%達(dá)完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解。Kantarjian等［12］研究表明，增加伊馬替尼劑量可以克服一些患者的血液學(xué)或細(xì)胞遺傳學(xué)的耐藥，但僅對(duì)低水平的伊馬替尼耐藥有效(如H386P型突變)，對(duì)高水平突變(如T315I或E255K)則無效。

2．2 第二代及第三代酪氨酸酶抑制劑 尼羅替尼及達(dá)沙替尼均為第二代酪氨酸激酶抑制劑。Ⅰ、Ⅱ期多中心臨床試驗(yàn)證明［13］，尼羅替尼和達(dá)沙替尼對(duì)于各期伊馬替尼耐藥和伊馬替尼不耐受的CML患者都顯示出顯著的臨床療效，其安全性和耐受程度也是可以接受的。尼羅替尼是選擇性ABL激酶抑制劑屬伊馬替尼的衍生物，其活性強(qiáng)于伊馬替尼30～100倍，對(duì)大多耐伊馬替尼的突變有效但不能抑制Src家族激酶和T315I突變。Le Coutre等［14］報(bào)道了尼洛替尼治療伊馬替尼耐藥或不耐受CML-AP(加速期)患者的療效。接受尼洛替尼治療(400 mg，bid)的119例CML-AP患者中獲得血液學(xué)緩解和細(xì)胞遺傳學(xué)緩解的患者分別為47%和29%，獲得血液學(xué)緩解和細(xì)胞遺傳學(xué)緩解的中位時(shí)間分別為1個(gè)月和2個(gè)月。12個(gè)月預(yù)期總生存率為79%。達(dá)沙替尼是一個(gè)Abl與Src家族雙向激酶抑制劑，對(duì)Abl/Src激酶有高度選擇性，對(duì)bcr/abl融合基因陽性細(xì)胞株的抑制作用比伊馬替尼強(qiáng)100～300倍，降低bcr/abl磷酸化活性的作用比伊馬替尼強(qiáng)1000倍。目前已報(bào)道的ABL激酶點(diǎn)突變超過100種，除T315I突變外，達(dá)沙替尼對(duì)其中許多突變都有臨床療效［15］。目前，達(dá)沙替尼已被美國美國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于治療伊馬替尼耐藥或不能耐受的CML患者。

第三代bcr/abl激酶抑制劑是Aurora激酶抑制劑，與第二代酪氨酸激酶抑制劑最大不同是具有ABLT315I突變特異結(jié)合能力，能克服T315I突變導(dǎo)致的耐藥，主要用于治療伊馬替尼及對(duì)第二代bcr/abl酪氨酸激酶抑制劑耐藥的T315I突變者。

2．3 逆轉(zhuǎn)MDR MDR是腫瘤細(xì)胞最重要的耐藥形式之一，它表現(xiàn)為細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時(shí)，對(duì)其他許多結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生耐藥性。齊靜等［16］采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)及流式細(xì)胞術(shù)分別從mRNA及蛋白水平檢測(cè)了伊馬替尼耐藥細(xì)胞系K562/G01的MDR水平，發(fā)現(xiàn)K562/G01有15．67%MDR表達(dá)，MDR參與了伊馬替尼耐藥發(fā)生。隨著人們對(duì)MDR形成機(jī)制研究的深入，逆轉(zhuǎn)MDR的作用靶點(diǎn)也逐漸從P-gp本身轉(zhuǎn)向其編碼基因MDR1。目前，藥物對(duì)抗MDR1/P-gp介導(dǎo)MDR的方法有:①化療藥物合用P-gp抑制劑;②增加化療藥物脂溶性使藥物迅速被吸收;③調(diào)節(jié)信號(hào)通路，抑制P-gp表達(dá)等。

2．4 bcr/abl下游通路抑制劑 在bcr/abl的眾多下游信號(hào)途徑中，能作為靶點(diǎn)的包括JAK/STAT、PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK。靶向Ras途徑的藥物有法尼?；D(zhuǎn)移酶，如Lonafarnib，已經(jīng)證實(shí)能成功地抑制野生型bcr/abl下游Ras信號(hào)途徑以及T315I突變細(xì)胞系，并且增強(qiáng)了伊馬替尼對(duì)早期慢粒原始祖細(xì)胞的細(xì)胞毒性［17］。在眾多PI3K/AKT信號(hào)抑制劑中，雷帕霉素和它的衍生物(RAD001)已被證實(shí)能提高伊馬替尼對(duì)bcr/abl過度表達(dá)的細(xì)胞和伊馬替尼耐藥細(xì)胞的抑制效應(yīng)［18］。索拉菲尼是近年來研究較多的藥物。它是一種多激酶抑制劑，最初設(shè)計(jì)為Raf(絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者)激酶抑制劑，后來研究發(fā)現(xiàn)其能同時(shí)抑制其他多種酪氨酸激酶，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板衍化生長(zhǎng)因子、受體酪氨酸激酶c-Kit、Fms樣酪氨酸激酶等多種受體酪氨酸激酶［19］。有研究顯示，索拉非尼聯(lián)合雷帕霉素、Bcl-2抑制劑GX15070可在體外誘導(dǎo)伊馬替尼耐藥細(xì)胞株凋亡［20］。

2．5 組蛋白去乙?；敢种苿?體外和體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACi)有廣泛的抗白血病細(xì)胞活性，包括阻斷細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增生、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、激發(fā)細(xì)胞凋亡。迄今為止，多種HDACi(如辛二酰苯胺氧肟酸，曲古菌素A、丙戊酸鈉等)已進(jìn)入血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤臨床試驗(yàn)階段，這些藥物不僅單獨(dú)使用可表現(xiàn)出抗腫瘤作用，有的還聯(lián)合其他藥物(如維甲酸等)起到協(xié)同作用，而且還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，使部分腫瘤耐藥現(xiàn)象得到顯著改善［21］。Nguyen 等［22］報(bào)道，HDACi(如 vorinostat或entinostat)能增強(qiáng)新型酪氨酸激酶抑制劑KW-2449對(duì)伊馬替尼耐藥的細(xì)胞作用，誘導(dǎo)其凋亡，其作用存在著時(shí)間和濃度依賴性。Zhang等［23］研究還顯示，HDACi和伊馬替尼聯(lián)用可以有效地誘導(dǎo)對(duì)伊馬替尼耐藥的CML中靜止的前體細(xì)胞凋亡，還可以清除植入免疫缺陷大鼠體內(nèi)的CML干細(xì)胞。HDACi可以有效清除接受酪氨酸激酶抑制劑治療的CML患者體內(nèi)的白血病干細(xì)胞。因此，HDACi是一類很有發(fā)展前景的藥物。

其他方法如蛋白酶體抑制劑、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑等均在研究中。

3 結(jié)語

甲磺酸伊馬替尼的耐藥機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，不僅涉及融合基因本身的結(jié)果和表達(dá)異常，還涉及多個(gè)基因/蛋白以及傳導(dǎo)通路的異常，新的機(jī)制也在不斷地被提出，但目前仍未完全闡明其耐藥機(jī)制。相信隨著對(duì)其耐藥機(jī)制研究的不斷深入，對(duì)逆轉(zhuǎn)耐藥的研究也將進(jìn)一步開展，這有助于進(jìn)一步提高CML患者的生存質(zhì)量及長(zhǎng)期生存率，也有助于進(jìn)一步揭示CML的發(fā)病機(jī)制。

［1］ Kim SH，Kim D，Kim DW，et al．Analysis of Bcr-Abl kinase domainmutations in Korean chronic myeloid leukaemia patients:poor clinical outcome of P-loop and T315I mutation is disease phase dependent［J］．Hematol Oncol，2009，27(4):190-197．

［2］ O'Hare T，Eide CA，Deininger MW．New Bcr-Abl inhibitors in chronic myeloid leukemia:keeping resistance in check［J］．Expert Opin Investig Drugs，2008，17(6):865-878．

［3］ Weisberg E，Griffin JD．Mechanism of resistance to the ABL tyrosine kinase inhibitor STI571 in BCR/ABL-transformed hematopoietic cell lines［J］．Blood，2000，95(11):3498-3505．

［4］ Thomas J，Wang LH，Clak RE，et al．Active transport of imatinib into and out of cells:implication for drug resistance［J］．Blood，2004，104(12):3739-3745．

［5］ Holtz MS，Slovak ML，Zhang F，et al．Imatinib mesylate(STI571)inhibits growth of primitive malignant progenitors in chronic myelogenous leukemia through reversal of abnormally increased proliferation［J］．Blood，2002，99(10):3792-3800．

［6］ 房佰俊，宋永平，林全德，等．慢性粒細(xì)胞性白血病干細(xì)胞抗伊馬替尼機(jī)制的初步分析［J］．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(46):9263-9267．

［7］ Fang BJ，Zheng CM，Liao LM，et al．Identification of human chronic myelogenous leukemia progenitor cells with hemangioblastic characteristics［J］．Blood，2005，105:2733-2740．

［8］ 齊靜．白血病耐藥新機(jī)制、新靶點(diǎn)研究［D］．北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2008．

［9］ Wu J，Meng F，Lu H，et al．Lyn regulates BCR-ABL and Gab2 tyrosine phosphorylation and c-Cbl protein stability in imatinib-resistant chronic myelogenous leukemia cells［J］．Blood，2008，111(7):3821-3829

［10］ 劉麗．AG490對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)理研究［D］．長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2010．

［11］ 王彥艷，沈志祥．伊馬替尼治療慢性粒細(xì)胞白血病的耐藥與對(duì)策［J］．中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2007，27(20):1586-1588．

［12］ Kantarjian HM，Talpaz M，O'brien S，et al．Dose escalation of imatinib mesylate can overcome resistance to standard-dose therapy in patients with chronic myelogenous leukemia［J］．Blood，2003，101(2):473-475．

［13］ 王璇，陳岷，申向黎，等．慢性粒細(xì)胞白血病的治療新進(jìn)展［J］．中國藥房，2008，19(20):1585-1587．

［14］ Le Coutre P， Ottmann OG， Giles F， et al． Nilotinib(formerlyAMN107)，a high selective BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor，is active in patients with imatinib-resistant or-intolerant accelerated phase chronic myelogenous leukemia［J］．Blood，2008，111(4):1834-1839．

［15］ Quintas-Cardama A，Cortes J．Therapeutic options against BCRABL-T315I-positive chronic myelogenous leukemia［J］．Clin Cancer Res，2008，14(14):4392-4399．

［16］ 齊靜，彭暉，顧振倫，等．伊馬替尼耐藥的K562細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性研究［J］．中華血液學(xué)雜志，2004，25(6):337-341．

［17］ J?rgensen HG，Allan EK，Graham SM，et al．Lonafarnib reduces the resistance of primitive quiescent CML cells to imatinib mesylate in vitro［J］．Leukemia，2005，19(7):1184-1191．

［18］ Dengler J，von Bubnoff N，Decker T，et al．Combination of imatinib with rapamycin or RAD001 acts synergistically only in Bcr-Abl positive cells with moderate resistance to imatinib［J］．Leukemia，2005，19(10):1835-1838．

［19］ 肖若芝，何程明，王立琳，等．索拉非尼聯(lián)合柔紅霉素對(duì)白血病K562細(xì)胞抑制作用［J］．中國病理生理雜志，2010，26(7):1356-1361．

［20］ Dong S，Kang S，Lonial S，et al．Targeting 14-3-3sensitizes native and mutant BCR-ABL to inhibition with U0126，rapamycin and Bcl-2 inhibitor GX15-070［J］．Leukemia，2008，22(3):572-577．

［21］ Glaser KB．HDAC inhibitors:clinical update and mechanism-based potential［J］．Biochem Pharmacol，2007，74(5):659-671．

［22］ Nguyen T，Dai Y，Attkisson E，et al．HDAC inhibitors potentiate the activity of the BCR/ABL kinase inhibitor KW-2449 in imatinib-sensitive or-resistant BCR/ABL+leukemia cells in vitro and in vivo［J］．Clin Cancer Res，2011，17(10):3219-3232．

［23］ Zhang B，Strauss AC，Chu S，et al．Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate［J］．Cancer Cell，2010，17(5):427-442．