PTEN基因?qū)ρ芷交〖?xì)胞影響的研究進(jìn)展

胡曉蔚(綜述)，方五旺(審校)

(皖南醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖241000)

1977年，Andreas Grüntzing第一次應(yīng)用經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，然而術(shù)后再狹窄問題在一定程度上影響了其遠(yuǎn)期療效，發(fā)生率高達(dá)30%～50%，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)是血管壁的主要成分，其增殖及遷移在血管成形術(shù)后的再狹窄過程中起重要作用。在藥物洗脫支架時代再狹窄發(fā)生率仍可達(dá)5% ～ 10%［1，2］。近 年 來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對再狹窄的認(rèn)識已深入到基因水平、基因治療，尤其是控制VSMC增殖和遷移的相關(guān)基因治療，在當(dāng)前是一個重要的研究方向。其有可能成為21世紀(jì)血管性疾病的一種新的、更有潛力的治療方法。

1 再狹窄機(jī)制

VSMC的增殖和遷移是血管成形術(shù)后再狹窄發(fā)生的最重要機(jī)制［3］。Curcio等［4］認(rèn)為支架的置入機(jī)械損傷引發(fā)一系列的反應(yīng):內(nèi)皮損傷、血管內(nèi)膜下的成分暴露;隨后血小板激活，在損傷部位沉積形成血栓，另外，脂質(zhì)的滲透使巨噬細(xì)胞聚集，兩者共同釋放細(xì)胞因子、有絲分裂原、趨化因子、血小板源性生長因子、凝血酶、β生長因子、表皮生長因子等;再者血管損傷后引起腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、血管緊縮素釋放增多，三者共同引起VSMC開始增殖，同時VSMC增殖也促進(jìn)腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、血管緊縮素釋放增多，隨著時間的推移，支架置入后的再狹窄逐漸形成。

由于血管重建術(shù)中的血管損傷刺激多種生長因子的復(fù)合作用而誘導(dǎo)VSMC的增殖和遷移，進(jìn)而引起內(nèi)膜增厚。其病理性增殖主要體現(xiàn)在其表型的轉(zhuǎn)變，即平滑肌細(xì)胞從收縮型向合成型的轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為復(fù)制能力增加，幾乎無收縮能力。中層平滑肌細(xì)胞的增殖在血管中膜平滑肌損傷后立即發(fā)生，48 h達(dá)到高峰，平均4 d，增殖的中層平滑肌細(xì)胞通過內(nèi)彈力膜的網(wǎng)狀孔間隙遷移到內(nèi)膜，進(jìn)一步增殖肥大，并由收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇?。在損傷后2個月左右增殖、肥大的平滑肌大量合成，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，引起內(nèi)膜進(jìn)一步增厚［5］。從基因治療角度調(diào)控VSMC的增殖和遷移，是防治再狹窄的一個重要方面。

2 PTEN基因的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制

PTEN基因由多功能磷酸酶編碼，是3個研究小組于1997年發(fā)現(xiàn)的第1個具有磷酸酶活性的抑癌基因。他們從蛋白結(jié)構(gòu)特征﹑在腫瘤中的突變及調(diào)節(jié)表達(dá)等3個領(lǐng)域進(jìn)行研究，分別將其命名為PTEN基因，多發(fā)性進(jìn)展期癌突變基因(mutation in multiple advanced cancer 1，MMAC1)和由轉(zhuǎn)化生長因子β1調(diào)節(jié)的、上皮細(xì)胞富含的磷酸酶基因(TGF-β1regulated and epithelial cell-riched phosphatase，TEP1)。在比較三個基因的cDNA和編碼的蛋白質(zhì)后證實(shí)PTEN/MMACl/TEP1三者為同一種基因。近年來，該基因已成為研究的熱點(diǎn)，也成為今后基因治療的又一潛在途徑。

2．1 PTEN基因的結(jié)構(gòu) PTEN基因是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一具有蛋白酯酶和磷酸酶活性的抑癌基因，由N端的磷酸酶結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域及C端的尾部結(jié)構(gòu)域組成。PTEN基因定位于人類染色體10q23，全長218 kb，含有9個外顯子和8個內(nèi)含子，mRNA長度為5500 bp;5'端有804個核苷酸的非翻譯區(qū)，其后有長度為1209個核苷酸組成的開放閱讀框架，編碼一個由403個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。PTEN基因的N末端是主要結(jié)構(gòu)功能區(qū)，第5個外顯子的第122～133位氨基酸序列(IHCKAGKGRTG)編碼，與蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶催化中心高度同源，典型氨基酸序列為HCXXGXGRXG，表明該區(qū)域具有蛋白酪氨酸磷酸酶和雙特異性磷酸酶的功能，是PTEN發(fā)揮腫瘤抑制活性的功能區(qū)［6］。C2結(jié)構(gòu)域與磷酸酶結(jié)構(gòu)域之間有密切的接觸面，兩者共同組成催化單位，如剪除C2結(jié)構(gòu)域C端少數(shù)殘基可使磷酸酶活性完全喪失。C端雖無磷酸酶活性，但對維持PTEN蛋白空間結(jié)構(gòu)的完整性起著重要作用，C端突變的PTEN將失去磷酸酶活性［7］。

2．2 PTEN基因的作用機(jī)制 PTEN基因在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、黏附和遷移、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和腫瘤微血管形成及維護(hù)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定等多種生理活動中發(fā)揮重要作用［8，9］。其作用機(jī)制尚未完全清楚，還有待于進(jìn)一步研究，在此主要敘述以下3個途徑。

2．2．1 磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3)途徑 研究發(fā)現(xiàn)純化的PTEN能使PIP3脫磷酸而轉(zhuǎn)變?yōu)榱字＜〈级姿?phosphatidylinositol-4，5-triphosphate，PIP2)，而 突 變 型PTEN則引起PIP3的積聚;確立了PIP3是PTEN的重要的生理性底物。PIP3是一些生長因子如胰島素樣生長因子、表皮細(xì)胞生長因子信號的第二信使，它激活的信號有助于細(xì)胞生存、抑制細(xì)胞調(diào)亡，其通過脫磷酸作用使PIP3轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP2，而抑制其活性，阻斷PIP3/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PTEN通過以下途徑發(fā)揮作用:①阻斷 PIP3/PKB信號通路，抑制細(xì)胞生存，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PKB在調(diào)控細(xì)胞生存/凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其激活可抑制凋亡信號，如使β1連鎖蛋白積聚、糖原合成激酶3磷酸化而失活，使凋亡前蛋白BAD(Bcl-2家族成員)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9磷酸化以抑制BAD與Bcl-xL(Bcl-2家族成員)的結(jié)合，同時上調(diào)生存信號。PTEN使PIP3脫磷酸而阻斷磷脂酰肌醇3位羥基激酶(phos phatidylinositide 3-OH kinase，PI3K)/PKB信號通路，使PKB活性下降，從而使PKB介導(dǎo)的提高細(xì)胞生存的效應(yīng)發(fā)生逆轉(zhuǎn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。②抑制PI3K/磷脂酞肌醇依賴的激酶1信號通道，調(diào)節(jié)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的磷酸化，從而抑制細(xì)胞分裂和增殖。PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)一促細(xì)胞分裂、增殖途徑，其是一效應(yīng)依賴的激酶，但其磷酸化途徑仍不十分清楚。目前的研究表明與PI3K有關(guān)，PKC的磷酸化可能通過依賴PI3K/磷脂酞肌醇依賴的激酶1的信號途徑［10-12］。

2．2．2 局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)途徑 FAK是一種胞內(nèi)非受體酪氨酸激酶，其調(diào)控的主要模式是通過整合素介導(dǎo)的黏附于細(xì)胞外基質(zhì)而被活化，使FAK酪氨酸磷酸化水平增高，并增加了其磷酸激酶的活性，F(xiàn)AK再作用于絲氨酸蘇氨酸激酶和磷酸酶，最終導(dǎo)致FAK去磷酸化而失活，從而阻斷FAK對絲裂原活化的蛋白激酶的調(diào)節(jié)，抑制細(xì)胞的增殖、浸潤及遷移等［13］。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因通過負(fù)向調(diào)控黏附過程和直接去磷酸化降低FAK及其下游信號分子p130Cas(p130 Crk-associated substance)酪氨酸磷酸化水平，從而抑制細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移;也可以通過FAK去磷酸化來抑制PI3K的活性，從而抑制PI3K/PKB通路。

2．2．3 絲裂原激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑 MAPK代表一個激酶家族，MAPK的活化是通過一個特殊的蘇氨酸和酪氨酸磷酸化來實(shí)現(xiàn)。MAPK的級聯(lián)反應(yīng)將信號由細(xì)胞表面?zhèn)鬟f至細(xì)胞核，并根據(jù)所接受的刺激或涉及的信號途徑的不同來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡。PTEN主要抑制胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路，和抑制 MAPK上游MAPK/ERK激酶、Ras蛋白的活化及連接蛋白Shc(是通過cDNA克隆篩選到的編碼SH結(jié)構(gòu)域的基因的蛋白產(chǎn)物)的磷酸化而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Kang-Park等［14］發(fā)現(xiàn)，PTEN通過其磷酸酶活性使得PKC、MAPK、MAPK激酶去磷酸化失活，阻斷胰島素樣生長因子信號途徑，最終誘導(dǎo)肝細(xì)胞瘤發(fā)生凋亡。而PTEN依賴性細(xì)胞凋亡可由下游分子 PKB的表達(dá)而挽救。2001年，Weng等［15］的研究結(jié)果顯示，PTEN主要通過MAPK依賴性胰島素反應(yīng)途徑抑制體外乳腺癌細(xì)胞模型生長。此后他們進(jìn)一步研究PTEN在乳腺癌細(xì)胞株MCF7中的作用時發(fā)現(xiàn)，PTEN能有效阻斷胰島素介導(dǎo)的癌基因ETS-2(E-Twenty-Six-2，ETS家族成員)的磷酸化作用，而PTEN的這種阻斷作用在于抑制MAPK家系中的ERK簇，并不影響PKB調(diào)控途徑。此外，在某些細(xì)胞系中，PTEN依賴性細(xì)胞凋亡不可能由PI3K之上游分子表達(dá)來獲救，這與PTEN在PIP3水平負(fù)調(diào)控PI3K/PKB通路相一致。

3 PTEN基因?qū)ρ艹尚涡g(shù)后再狹窄的影響

PTEN基因具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤細(xì)胞生長、侵襲轉(zhuǎn)移等主要功能，還在胚胎的生長、發(fā)育，細(xì)胞黏附和遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞衰老與凋亡、維護(hù)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定等多種生理活動中發(fā)揮重要作用［8，9］。目前關(guān)于 PTEN在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中研究較多，而在心血管疾病方面還需要大量的實(shí)驗(yàn)對它的作用及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。有證據(jù)表明，PTEN顯著抑制損傷后VSMC向傷口的遷移。Schwartzbauer等［16］報(bào)道，增加重組腺病毒PTEN基因表達(dá)能提高半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3活性和裂解多腺苷二磷酸多聚酶，從而誘導(dǎo)原代新生鼠心肌細(xì)胞的凋亡，同時阻斷經(jīng)PI3K途徑的信號;并發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞的肥大同時伴有PKB活性的增加。Dimmeler等［17］報(bào)道PTEN基因作用上游的重要增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如磷酸肌醇依賴性激酶的激活，阻斷磷脂結(jié)合 PKB活化所必需的結(jié)構(gòu)域，從而抑制VSMC增殖和遷移，增加誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Huang等［18］通過腺病毒體外轉(zhuǎn)染使兔VSMC過表達(dá)PTEN，抑制血小板衍生生長因子、核糖體蛋白質(zhì)S6激酶、PKB的磷酸化和糖原合酶激酶3α和β，調(diào)控VSMC增殖與遷移。Selvendiran等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在體外人主動脈VSMC和體內(nèi)大鼠頸動脈球囊損傷模型中，由HO-3867(一種新合成的類姜黃色素)通過上調(diào)PTEN的表達(dá)調(diào)控抑制VSMC增殖和血管再狹窄，HO-3867通過上調(diào)PTEN表達(dá)和下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶、核因子κB蛋白，抑制動脈內(nèi)膜的增生。Huang等［20］使用大鼠頸動脈球囊損傷，然后用重組腺病毒介導(dǎo)的PTEN基因轉(zhuǎn)染至大鼠頸動脈，證明了PTEN基因過表達(dá)抑制內(nèi)膜增生、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制中膜細(xì)胞增殖，主要是通過調(diào)節(jié)抑制PI3K。Mourani等［21］研究比較胚胎鼠、頸動脈球囊損傷和不做頸動脈球囊損傷的大鼠后PTEN的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，PTEN的活性降低，能抑制體內(nèi)VSMC的增長率，其機(jī)制也主要是負(fù)性調(diào)控體內(nèi)的PI3K信號。Garl等［22］在動物頸動脈球囊損傷的模型中，研究了基底膜蛋白多糖和PTEN基因在VSMC生長規(guī)律的相關(guān)性，證明了基底膜蛋白多糖介導(dǎo)PTEN基因活性可以抑制VSMC增殖，并用免疫組織法測定假手術(shù)和球囊損傷頸動脈組織中時間對PTEN蛋白表達(dá)的影響，PTEN蛋白總含量在動脈血管損傷內(nèi)膜增長檢測到水平顯著升高。與此相反，假手術(shù)組PTEN蛋白檢出率相應(yīng)較低。在術(shù)后第2天，VSMC內(nèi)膜中可以檢測到磷酸化PTEN蛋白，術(shù)后4～10 d，大量的磷酸化PTEN蛋白在內(nèi)膜檢測出，術(shù)后14 d，磷酸化PTEN蛋白表達(dá)大大減少，而且術(shù)后28 d幾乎檢測不到。Koide等［23］在動脈內(nèi)膜損傷部位的注射腺病毒介導(dǎo)的PTEN和腺病毒介導(dǎo)的乳糖操縱子Z基因進(jìn)行比較，14 d后組織病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，腺病毒介導(dǎo)的PTEN組較對照組相比能夠明顯減少新內(nèi)膜形成，減少細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能部分通過抑制炎性反應(yīng)，包括抑制巨噬細(xì)胞的侵入和炎性因子的表達(dá)。

4 小結(jié)及展望

PTEN基因的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是抑癌基因研究領(lǐng)域的又一重要里程碑。PTEN的存在、發(fā)現(xiàn)與研究給心血管疾病診治帶來新的思路、線索甚或是突破。目前關(guān)于PTEN基因在心血管疾病方面的研究較少，還需要大量的實(shí)驗(yàn)對它的作用及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。相信隨著研究的不斷深入，將會更清楚PTEN基因在心血管疾病防治中的作用，為基因治療提供新的思路，PTEN的研究仍任重道遠(yuǎn)。

［1］ Vassilev D，Doganov A，Gil RJ．The role of angiotensin receptor 1 blockers in restenosis prevention after percutaneous coronary inter-ventions［J］．Kardiol Pol，2010，68(1):97-101．

［2］ Merkely B，Jambrik Z．Drug-eluting balloon in the treatment of a recurrent in-stent restenosis of drug-eluting stent［J］．Orv Hetil，2010，151(37):1509-1514．

［3］ Brown DA，Lee EW，Loh CT，et al．A new wave in treatment of vascular occlusive disease:biodegradable stents--clinical experience and scientific principles［J］．Vasc Interv Radiol，2009，20(3):315-324．

［4］ Curcio A，Torella D，Indolfi C．Mechanisms of smooth muscle cell proliferation and endothelial regeneration after vascular injury and stenting:approach to therapy［J］．Circ J，2011，75(6):1287-1296．

［5］ Min SK，Kenagy RD，Clowes AW．Induction of vascular atrophy as a novel approach to treating restenosis［J］．Vasc Surg，2008，47(3):662-670．

［6］ McCall P，Witton CJ，Grimsley S，et al．Is PTEN loss associated with clinical outcome measures in human prostate cancer［J］．Br J Cancer，2008，99(8):1296-1301．

［7］ Manna D，Bhardwaj N，Vora MS，et al．Differential roles of phosphatidylserine，PtdIns(4，5)P2，and PtdIns(3，4，5)P3 in plasma membrane targeting of C2 domains．Molecular dynamics simulation，membrane binding，and cell translocation studies of the PKCalpha C2 domain［J］．Biol Chem，2008，283(38):26047-26058．

［8］ Ni Z，Tang J，Cai Z，et al．A new pathway of glucocorticoid action for asthma treatment through the regulation of PTEN expression［J］．Respir Res，2011，12(1):47．

［9］ Hill R，Wu H．PTEN，stem cells，and cancer stem cells［J］．J Biol Chem，2009，284(18):11755-11759．

［10］ Fan C，He L，Kapoor A，et al．PTEN inhibits BMI1 function independently of its phosphatase activity［J］．Mol Cancer，2009，8(1):98．

［11］ Cid VJ，Rodríguez-Escudero I，Andrés-Pons A，et al．Assessment of PTEN tumor suppressor activity in nonmammalian models:the year of the yeast［J］．Oncogene，2008，27(41):5431-5442．

［12］ Kortholt A，Bolourani P，Rehmann H，et al．A Rap/phosphatidylinositol 3-kinase pathway controls pseudopod formation［J］．Mol Biol Cell，2010，21(6):936-945．

［13］ Lan H，Zhong H，Gao Y，et al．The PTEN tumor suppressor inhibits human airway smooth muscle cell migration［J］．Int J Mol Med，2010，26(6):893-899．

［14］ Kang-Park S，Lee YI，Lee YI．PTEN modulates insulin-like growth factorⅡ(IGF-Ⅱ)mediated signaling;the protein phosphatase activity of PTEN downregulates IGF-Ⅱexpression in hepatoma cells［J］．FEBS Lett，2003，545(223):203-208．

［15］ Weng LP，Brown JL，Baker KM，et al．PTEN blocks insulinmediated ETS-2 phosphorylation through MAP kinase，independently of the phosphoinositide 3-kinase pathway［J］．Hum Mol Genet，2002，11(15):1687-1696．

［16］ Schwartzbauer G，Robbins J．The tumour suppressor gene PTEN can regulate cardiac hypertrophy and survival［J］．Biol Chem，2001，276(38):35786-35793．

［17］ Dimmeler S，Zeiher AM．PTEN-uating Restenosis［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22(5):715-716．

［18］ Huang J，Kontos CD．Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation，migration，and survival by the tumor suppressor protein PTEN［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22(5):745-751．

［19］ Selvendiran K，Kuppusamy ML，Bratasz A，et al．Inhibition of Vascular Smooth-Muscle Cell Proliferation and Arterial Restenosis by HO-3867，a Novel Synthetic Curcuminoid，through Up-Regulation of PTEN Expression［J］．J Pharmacol Exp Ther，2009，329(5):959-966．

［20］ Huang J，Niu XL，Anne M，et al．Adenovirus-Mediated Intraarterial Delivery of PTEN Inhibits Neointimal Hyperplasia［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(2):354-358．

［21］ Mourani PM，Garl PJ，Wenzlau JM，et al．Unique，highly proliferative growth phenotype expressed by embryonic and neointimal smooth muscle cells is driven by constitutive Akt，mTOR，and p70S6K signaling and is actively repressed by PTEN［J］．Circulation，2004，109(10):1299-1306．

［22］ Garl PJ，Wenzlau JM，Walker HA，et al．Perlecan-induced suppression of smooth muscle cell proliferation is mediated through increased activity of the tumor suppressor PTEN［J］．Circ Res，2004，94(2):175-183．

［23］ Koide S，Okazaki M，Tamura M，et al．PTEN reduces cuff-induced neointima formation and proinflammatory cytokines［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292(6):2824-2831．