小鼠子宮內(nèi)膜干細胞的研究進展

王燕華(綜述)，曲軍英(審校)

(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，福州350004)

干細胞是一類具有高度增殖、自我更新和分化潛能的細胞，分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞為囊胚的內(nèi)細胞團，具有高度自我更新和全能性，能夠分化為三個胚層的各種細胞［1］。成體干細胞是一類位于很多組織器官中的一小群細胞，也稱為祖細胞，其可通過不對稱分裂進行自我更新和產(chǎn)生不同譜系的子細胞［2］。由于人子宮內(nèi)膜干細胞在現(xiàn)實研究中受到限制，小鼠子宮內(nèi)膜干細胞研究可能成為一個重要的研究模型。

1 小鼠子宮內(nèi)膜干細胞鑒別與定位技術(shù)

在干細胞鑒別與定位常用的技術(shù)中最常用的是標記滯留細胞技術(shù)。標記滯留細胞技術(shù)是利用溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)標記細胞，在DNA復制過程中攝取BrdU為合成原料而標記細胞，利用DNA半保留復制的特點，在注入BrdU后的追蹤過程中快速增殖的細胞將稀釋甚至丟失標記，由于干細胞有慢細胞周期和半保留復制等特點，細胞內(nèi)將仍保留有BrdU標記，通過用特異性的抗BrdU抗體，檢測到的BrdU滯留細胞有可能是成體干細胞［3］。由于BrdU標記后對子宮內(nèi)膜干細胞定位和定量是通過免疫組織化學技術(shù)反應進行的，因此其不適用活體子宮內(nèi)膜干細胞研究，且其定量受到免疫組化過程中各種因素的影響，不能準確地反映實際子宮內(nèi)膜干細胞的量。

Hoechst 33342-SP法是近年來廣泛用于篩選成體干細胞的一種方法。Hoechst 33342是一種能與 DNA特異性結(jié)合的熒光染料，癌細胞［4］和 干 細 胞［5］可 以 將Hoeehest 33342排出細胞，表現(xiàn)為細胞核不著色或者低程度著色，利用流式細胞儀可以將這些不著色細胞加以分離，人們將這種可以排除Hoechest 33342的特性稱為SP表型，將利用該特性分離的這部分細胞稱為SP細胞［6］，Hoechst 33342-SP法可用于研究小鼠子宮內(nèi)膜干細胞［7］，也可用于研究人子宮內(nèi)膜干細胞［8］，但都只適用于體外研究，不適用于干細胞體內(nèi)細胞定位。

2 小鼠子宮內(nèi)膜干細胞在子宮內(nèi)膜的定位

子宮內(nèi)膜干細胞常處于靜止期(G0期)，位于保護的微環(huán)境中，這種環(huán)境稱為“壁龕”［9］。隨著細胞的分裂分化，子宮內(nèi)膜干細胞在子宮內(nèi)膜的位置將發(fā)生變化。Cervelló等［10］研究發(fā)現(xiàn)，出生3 d的小鼠注射BrdU后追蹤，注射后7 d，所有上皮和間質(zhì)細胞均表達BrdU，隨后在小鼠青春期前(21～49 d)BrdU陽性細胞劇減，21 d時，所有上皮細胞均丟失BrdU，表達BrdU的間質(zhì)細胞數(shù)量劇減，到成年(49 d)后，只有少量位于內(nèi)膜基層連接處，血管周圍旁邊的間質(zhì)細胞表達BrdU。

有學者研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后小鼠子宮內(nèi)膜具有更多的干/祖細胞(SP細胞)，其用Hoechst 33342-SP法在產(chǎn)后第1、3、7、14、17．5、21、28 天的小鼠內(nèi)膜中均可測得SP細胞群，其含量隨產(chǎn)后時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在產(chǎn)后17．5 d子宮內(nèi)膜中SP細胞群達到最大含量，隨后逐漸下降，在產(chǎn)后60 d幾乎無法測得，原因可能為分娩過程中子宮內(nèi)膜受損所致［6，11］。因此，認為產(chǎn)后是子宮內(nèi)膜干細胞生理性募集的時間點，在這一時期，某些信號轉(zhuǎn)導啟動細胞募集、增殖、分化，重建完整的組織;但在研究中并未對這些干/祖細胞在子宮內(nèi)膜中的定位進行分析。

3 子宮內(nèi)膜干細胞表面標志

目前尚未發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜干細胞表達特異性標記。與人子宮內(nèi)膜干細胞一樣，小鼠子宮內(nèi)膜干細胞也表達未分化的干細胞標志。Szotek等［2］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠子宮內(nèi)膜干細胞表達干細胞標志(干細胞抗原1、sca-1)、內(nèi)皮標志CD31、成纖維細胞標志平滑肌激動因子α、雌激素受體α，不表達造血細胞標志CD45。Cervelló等［10］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠子宮內(nèi)膜細胞表達未分化標志c-Kit和POU5F1(一種核轉(zhuǎn)錄因子)。而Chan等［12］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠子宮內(nèi)膜干細胞表達干細胞抗原 1、CD31、CD45、Ki-67(增殖標志)、雌激素受體α、平滑肌激動因子α，不表達c-Kit?？傊?，子宮內(nèi)膜干細胞表面標志目前尚無統(tǒng)一定論，眾多學者仍致力于此方面的研究。

4 子宮內(nèi)膜干細胞的分離與培養(yǎng)

胡菲菲等［6］從生育期小鼠四個動情期(動情前期、動情期、動情后期、動情間期)和產(chǎn)后小鼠子宮內(nèi)膜分離干細胞，并比較從這些小鼠子宮內(nèi)膜中分離出的子宮內(nèi)膜干細胞的量，首先用酶法獲得子宮內(nèi)膜細胞，再用Hoechst 33342染色，維拉帕米阻止細胞內(nèi)Hoechst 33342排出，再用流式細胞儀熒光活化分選系統(tǒng)將被染色細胞分選出來培養(yǎng)，結(jié)果從未孕小鼠四個動情期均未分離出干細胞，而能從產(chǎn)后小鼠子宮內(nèi)膜中分離出干細胞，其原因為正常動情期鼠子宮內(nèi)膜干細胞較少，Hoechst 33342-SP法不能靈敏地將其分離出來。分離獲得的子宮內(nèi)膜干細胞采用有限稀釋法培養(yǎng)，培養(yǎng)液成分為dulbecco modified eagle medium(DMEM)/Ham's，10% 胎牛血清，1%青/鏈霉素，培養(yǎng)15 d后見細胞克隆，并認為添加上皮生長因子和17β雌二醇對小鼠子宮內(nèi)膜干細胞體外培養(yǎng)并不能增加其克隆形成率，且雌激素在體外有促進腺體克隆細胞分化的作用。有研究發(fā)現(xiàn)上皮生長因子在一定濃度范圍內(nèi)可促進子宮內(nèi)膜上皮細胞生長［13］。Komatsu 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，上皮生長因子和轉(zhuǎn)錄生長因子α可刺激子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞生長，但對這種促進作用產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導通路并未闡明。小鼠子宮內(nèi)膜干細胞體外培養(yǎng)目前是比較新的研究領(lǐng)域，對于內(nèi)膜干細胞分離培養(yǎng)技術(shù)、細胞因子添加的種類和量及其作用機制目前尚無統(tǒng)一的研究結(jié)果。

5 小鼠子宮內(nèi)膜干細胞體外培養(yǎng)分化

Meng等［15］研究發(fā)現(xiàn)，從人的月經(jīng)血中收集子宮內(nèi)膜干細胞在體外培養(yǎng)，用完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜貼壁后，更換成成骨細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d可誘導分化為成骨細胞、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞;換成肝細胞和胰腺細胞誘導培養(yǎng)基，并添加肝細胞生長因子、纖維母細胞等細胞因子培養(yǎng)30 d，可誘導成肝細胞和胰腺細胞;培養(yǎng)過夜貼壁后，用含有5-氮雜胞苷的DMEM處理24 h后，用添加有骨骼肌生成因子、纖維母細胞生長因子等細胞因子的DMEM培養(yǎng)40 d，可誘導分化為心肌細胞和骨骼肌細胞;用完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)到細胞至100%匯合時，更換成脂肪細胞、肺上皮細胞誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后可誘導成脂肪細胞和肺上皮細胞。Dimitrov等［16］從子宮內(nèi)膜基底層分離子宮內(nèi)膜干細胞體外培養(yǎng)可形成克隆，將這些細胞培養(yǎng)與脂肪細胞誘導培養(yǎng)基后可誘導分化為脂肪細胞。而在小鼠子宮內(nèi)膜干細胞培養(yǎng)方面，目前尚未有體外誘導分化的報道。

6 結(jié)語

子宮和子宮內(nèi)膜是維持女性生理功能和生育能力的重要器官，子宮內(nèi)膜具有強大的增殖能力。然而，子宮內(nèi)膜極易受流產(chǎn)、感染和內(nèi)分泌影響，而導致增生能力下降，從而嚴重影響女性的生育能力。同樣，子宮內(nèi)膜增殖能力過度也會導致諸如子宮內(nèi)膜異位癥、功能性子宮出血、子宮內(nèi)膜增生過長、子宮內(nèi)膜癌等諸多疾病，嚴重影響女性健康和生活質(zhì)量。子宮內(nèi)膜干細胞研究對于諸如此類的女性生殖健康疾病有著重要意義，可從根本上解決這些問題。人子宮內(nèi)膜干細胞研究受到很多方面的限制，因此，小鼠模型起著重要的作用。目前，小鼠子宮內(nèi)膜干細胞研究尚處于初級階段，還有許多尚未解決的問題，因此小鼠子宮內(nèi)膜干細胞研究具有廣闊的前景。

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