線栓法致大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的制作及思考

汪 亮，劉潘潘，胡勤樂

(1．寧波大學醫(yī)學院研究生部，浙江寧波315211;2．浙江大學醫(yī)學院研究生部，杭州310058;3．寧波市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江寧波315010)

隨著人口的老齡化，腦血管疾病已經(jīng)成為世界上危害人類健康的三大疾病之一。我國每年新發(fā)腦卒中病例已超過200萬，其中缺血性腦卒中占80%以上，其致殘率和腦損傷程度均超過腦出血。而缺血性腦血管疾病中，尤以大腦中動脈閉塞最為常見［1］。因此制備一種理想的大腦中動脈腦缺血/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)是研究缺血性腦血管病的前提條件。目前，制備MCAO/R模型的方法較多，其中線栓法致MCAO/R模型備為推崇。線栓法建立大鼠大腦中動脈阻塞缺血模型不需開顱，創(chuàng)傷小，不影響腦缺血后腦水腫和顱內壓等病理變化，特別適合于局部損傷后腦功能改變及治療藥物評價等實驗研究［2，3］。本研究在參考一些經(jīng)典線栓法的基礎上，對“腦缺血/再灌注損傷保護”進行思考、探索，為研究局灶性腦缺血/再灌注損傷提供一種較為理想、可靠且操作較為簡便的實驗動物模型制作方法。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 健康雄性大鼠32只(體質量250～280 g)，由浙江省醫(yī)學科學院提供。隨機分為2組，手術組和假手術組分別為20只和12只。

1．2 栓線準備 市售3-0號魚線，直徑為0．256 mm。其制備方法:先浸入0．1%多聚賴氨酸溶液中，再放入50℃烤箱中干燥，取出后頭端涂以硅橡膠，然后懸掛陰干。

1．3 模型制備 大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0．4 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術臺上，頸部皮膚備皮消毒，取頸部右側旁正中切口，鈍性分離皮下組織、右側胸鎖乳突肌及頸前部肌群，然后暴露并游離右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)約1 cm，并于近心端將之結扎，遠心端(靠近CCA及分叉處)掛線以便于牽拉和向遠端分離，并可在后續(xù)操作中防止栓線滑落和減少出血。操作中注意仔細分離迷走神經(jīng)，避免牽拉損傷迷走神經(jīng)而致呼吸驟停。找到CCA分叉后，繼續(xù)分離頸外動脈(external carotid artery，ECA)將之結扎，牽拉ECA進一步分離頸內動脈，并掛線向遠端進一步分離頸內動脈(internal carotid artery，ICA)主干以便于調整插線方向與角度。用眼科剪于CCA結扎的遠心端(距CCA分叉處約2 mm)斜行45°剪一小口并導入栓線，導入后單結稍打緊預留在CCA的掛線以減少出血，調整好插線方向及角度，栓線經(jīng)CCA順利進入ICA，此時放松CCA單結，繼續(xù)將栓線往前推送，直至到達大腦中動脈起始部，遇阻力停止，長度18～20 mm。雙結打緊住栓線，確認無出血后縫合皮膚，術后1．5 h后抽出線栓。假手術組只結扎CCA而不導入線栓。

1．4 神經(jīng)功能缺損評分 大鼠缺血/再灌注24 h后，對其進行神經(jīng)功能缺損評分。參照經(jīng)典的Zea Longa法［4］:無神經(jīng)功能缺損癥狀為0分;輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展對側前爪為1分;中度局灶性神經(jīng)功能缺損，向對側轉圈為2分;重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向對側傾倒為3分;不能自發(fā)行走且意識水平下降為4分。

1．5 氯化三苯四氮唑(tetrazolium chloride，TTC)染色 大鼠缺血/再灌注24 h后給予左心室磷酸鹽緩沖液灌注，然后斷頭取腦，取腦時發(fā)現(xiàn)有蛛網(wǎng)膜下腔出血者給予排除;取出鼠腦后置于－20℃冰箱中快速冰凍約15 min，然后冠狀位均勻切成2 mm厚度腦組織5～6片;將切好的腦片置于2%的TTC磷酸鹽緩沖液中，避光后給予37℃恒溫水箱孵育15～30 min，待完全顯色后置于4%多聚甲醛固定。

2 結果

2．1 大鼠神經(jīng)行為觀察 大鼠腦缺血/再灌注24 h后，手術組有15只大鼠神經(jīng)功能缺損評分為1～2分，出現(xiàn)行走時左側肢體伸展不全，以前肢為重，有部分大鼠可出現(xiàn)向對側轉圈，提起鼠尾時左側前肢無力屈曲，反抗力明顯減弱;1只大鼠在麻醉后手術過程中死亡;1只大鼠取腦時發(fā)現(xiàn)存在蛛網(wǎng)膜下腔出血;2只大鼠神經(jīng)功能缺損不明顯，評分為0～1分;1只大鼠術后神經(jīng)功能缺損評分可達3～4分，24 h后發(fā)現(xiàn)已死亡。模型成功率為75%。假手術組神經(jīng)行為則與正常小鼠無明顯差別。

2．2 TTC染色 存活大鼠24 h后取腦切片，手術組造模成功大鼠腦冠狀切面經(jīng)TTC法染色后，可見右側尾狀核及額頂皮質不同程度的蒼白色梗死區(qū)。假手術組TTC染色后為正常紅色腦組織。

3 討論

3．1 動物選擇 大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)腦血管變異較少，種系純性好，價廉易得，具有極強的抗感染能力，已成為目前最常用的局灶性腦缺血模型動物材料。而在不同的大鼠品種之間，SD大鼠進行MCAO/R建模后，梗死面積較大較固定且價廉易得，故采用SD種系大鼠為建立MCAO/R模型最常用大鼠。老齡大鼠大腦中動脈已發(fā)生不同程度的動脈扭曲或官腔狹窄，使得線栓難以推進，故在目前實驗操作中，仍以青壯年雄性大鼠作為實驗對象［5］。

3．2 麻醉劑的選擇 制作MCAO/R模型可有多種麻醉劑選擇，國外制作該模型目前多采用氟烷誘導麻醉，繼以將氧化亞氮與純氧按比例混合后，行機械通氣維持吸入麻醉，但價格昂貴，步驟繁瑣。而國內學者多用10%水合氯醛腹腔內注射，國內張彥等［6］認為，采用10%水合氯醛作為制作MCAO/R模型的麻醉劑效果較好。

3．3 線栓選擇及處理 辛世萌等［7］曾通過大量研究實驗，提出線栓直徑及插入的長度應與大鼠體質量呈正比，大鼠體質量250～330 g，插入線長17 mm或18 mm，栓線直徑0．28 mm為最佳匹配方案，制作的MCAO/R模型成功率高、重復性好、生理指標影響小，適合用于探討腦缺血/再灌注機制及評價藥物療效。最近鄭建明等［8］通過研究指出，使用直徑為0．28 mm和頭端直徑為0．32～0．34 mm的栓線能較為顯著地提高模型的穩(wěn)定性。國外文獻已有報道，相同號碼線栓對不同體質量大鼠造模效果不一致［9］。本研究采用250～300 g大鼠，線栓進入長度18 mm左右，結果20只中僅有1只出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血，考慮原因是栓線穿破顱底動脈，或是栓線與顱底動脈產生粘連，在拔栓線時將顱底動脈撕破所致。另外2只神經(jīng)功能評分為0～1分，TTC染色為較小范圍梗死灶，考慮為栓線插入過短從而未導致完全性大腦中動脈閉塞。國外學者Durukan等［10］也指出這種模型存在一些缺點:①易出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血，病死率較高;②常出現(xiàn)不能完全閉塞大腦中動脈的現(xiàn)象。栓線頭部的正確處理已經(jīng)公認成為影響制備大鼠MCAO/R模型的重要因素，有學者曾提出可將栓線頭端燙成光滑的圓球。Ma等［11］將更細直徑的6-0單股尼龍線表面涂以硅樹脂制備的栓線，經(jīng)ICA超選擇性進入大鼠的大腦中動脈。而本研究采用的栓線頭端覆以左旋多聚氨酸，從而使線栓與血管壁的黏附性增加，彌補了大鼠體重及血管大小的個體差異所致的線栓表面與血管壁間的微小間隙，從而完全阻斷血流，可以增加缺血穩(wěn)定性?？傊?，線栓端部如何處理還需要大量的實驗研究，線栓端部處理是否合理已經(jīng)公認為實驗成功的關鍵。

3．4 手術方式的選擇 線栓的插入傳統(tǒng)上有兩種方法:一種是采用從ICA或CCA插入線栓。另一種方法是采用頸外動脈切口，插入后向下，輕按ECA使之與ICA成近似直線，順ECA走向在頸內動脈中緩慢推進直至感覺有少許阻力為止。由于缺少經(jīng)驗，本組采用了第一種線栓插入方法，即從CCA插入線栓，效果較為滿意。而王毅剛等［12］采用了距CCA分叉1 cm處的切口，不分離ECA和ICA，且不結扎ECA的手術方法，通過調整進線角度使線栓從CCA順行進入ICA，進而入顱堵塞大腦中動脈，取得良好效果。在模型制作過程中，遇到的最大困難是栓線插線時的大出血，以及有時栓線無法正確插入ICA，故除了用血管夾夾閉ECA、ICA外，可直接在ECA、ICA套上一根絲線牽拉，既有助于手術分離，又有助于控制出血。武強等［13］的模型做法是先以2個微動脈分別夾閉CCA和ICA，然后切斷ECA，由斷端送入栓線至CCA分叉處，然后翻轉方向，松開夾閉ICA的微動脈夾，將栓線向內上方向角度緩慢在ICA內推進。若線栓誤入翼腭動脈，則可先用微動脈夾臨時夾閉。國內孫宇等［14］學者指出，通過永久結扎大鼠頸總動脈近心端，不游離翼腭動脈，由頸總動脈分叉處將線栓插入大腦中動脈方法制備MCAO再灌注模型是可行的，能明顯減少造模的時間。而本組在操作上也未對大鼠的翼腭動脈加以分離及處理，因為翼腭動脈位置深在，若結扎該動脈，神經(jīng)肌肉損害嚴重，可能會引起進食困難，給大鼠造成極大傷害，增加大鼠的死亡率。在手術操作過程中，保持室溫在25～30℃，在分離動脈過程中，注意保護沿著ECA、CCA走行的迷走神經(jīng)，防止呼吸道分泌物過多。呼吸道分泌物過多時可適當吸痰，術后注意保溫，這些措施可以提高動物的生存率。

目前，MCAO/R模型在制備方法、實驗條件的控制等方面都取得了很大進展。轉基因大鼠的出現(xiàn)，超聲、介入等新技術的發(fā)展及其在模型制備中的應用，也在很大程度上促進了MCAO/R模型的研究。線栓制備MCAO/R模型的影響因素較多，最近國外有文獻指出大鼠的年齡和性別都嚴重影響著該模型的效果［15］，故應該首先對整體的實驗體系進行全面評估和調整，盡可能優(yōu)化制備MCAO/R模型的實驗條件，從而制備出可靠、穩(wěn)定、重復性好、成功率高的理想的MCAO/R模型，為腦缺血病理生理的研究和治療藥物的研制發(fā)揮更加科學有效的作用。

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