p53靶位基因Wig-1——腫瘤與干細胞新的調(diào)控因子

曾 英(綜述)，肖華亮(審校)

(第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所病理科，重慶400042)

抑癌基因p53通過修復(fù)損傷DNA和抑制癌基因激活發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的功能，激活p53使細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡［1，2］。p53人類腫瘤中突變頻率達50%［3］。p53發(fā)揮抑瘤功能主要是作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)其靶位基因的表達，因此深入研究p53靶位基因的功能對完全闡明p53的功能是至關(guān)重要的。Wig-1(wild-type p53-induced gene 1)是p53基因的靶位基因之一，野生型p53可以激活Wig-1誘導細胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)Wig-1作為p53信號通路下游分子具有重要功能，闡明Wig-1的功能對于全面理解p53信號通路具有重要意義。

1 Wig-1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特征

Wig-1，也叫 PAG608 或ZMAT3，是最早作為 p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的直接靶位基因發(fā)現(xiàn)的。小鼠的 Wig-1是在J3D小鼠T淋巴瘤細胞(帶有溫度敏感的Val135突變p53元件)中發(fā)現(xiàn)的［4，5］。另一個實驗室用相似的方法在小鼠髓細胞性白血病細胞系LTR6克隆出同樣的基因，命名為PAG608［6］。后來不同的研究小組克隆了人 Wig-1，并證實 Wig-1是 p53的靶位基因［7，8］。人 Wig-1 8 kb 和6 kb 轉(zhuǎn)錄本在結(jié)腸癌細胞系HCT116和LoVo(帶有野生型TP53)表達上調(diào)，但是在缺少野生型TP53的DLD1細胞系中表達不上調(diào)，說明p53能夠誘導Wig-1表達。野生型p53使Wig-1的mRNA和蛋白水平表達上調(diào)，過表達Wig-1基因可以抑制腫瘤細胞的生長，表明Wig-1基因可能在依賴p53的生長調(diào)控途徑中起作用。

Wig-1位于人染色體3q26．32，全長2432 bp，及6個外顯子，包含870 bp的開放性閱讀框，其蛋白結(jié)構(gòu)存在2種亞型，兩者僅差別一個氨基酸，Wig-1開放閱讀框包含288或289氨基酸，開放閱讀框后面帶有包含3個polyA的3'UTR，大約長8 kb。Wig-1包含3個帶有Cys2His2鋅指結(jié)構(gòu)蛋白及一個核定位信號。鋅指結(jié)構(gòu)之間的組氨酸距離由5個氨基酸代替正常3～4個氨基酸，鋅指結(jié)構(gòu)之間連接也是由56～75氨基酸代替大多數(shù)鋅指結(jié)構(gòu)的6～8個氨基酸，這種鋅指結(jié)構(gòu)極為罕見，是缺乏一致雙鏈RNA(doublestranded RNA，dsRNA)結(jié)合模序的dsRNA結(jié)合蛋白所共有的，這組dsRNA結(jié)合蛋白在結(jié)合特異性、結(jié)合緊密程度及結(jié)合跨越空間上均具有較強的靈活性。現(xiàn)在研究最為清楚的dsRNA結(jié)合蛋白是JAZ，JAZ結(jié)合dsRNA核輸出受體Exportin-5［9］，通過結(jié)合p53蛋白從而正向調(diào)節(jié) p53轉(zhuǎn)錄活性［10］。像 JAZ一樣，Wig-1也是一種RNA結(jié)合蛋白，它可結(jié)合＞50 bp的dsRNA，也可以結(jié)合單鏈RNA和RNA-DNA雜交分子，但是dsRNA是其最佳靶位［11］。第一鋅指結(jié)構(gòu)和第二鋅指結(jié)構(gòu)對于結(jié)合 dsRNA 是必需的［11，12］。Wig-1也可以結(jié)合大約21 bp的短鏈RNA，但僅是這些類似microRNA(miRNA)的小RNA。Dicer是一種對miRNA成熟至關(guān)重要的核糖核酸酶Ⅲ，Wig-1在缺失Dicer的胚胎干細胞(embryonic stem cells，ES細胞)中表達下調(diào)，這提示W(wǎng)ig-1可能具有和miRNA相關(guān)的功能［13］。

Wig-1在結(jié)構(gòu)上從魚類到人類都是保守的，特別是鋅指結(jié)構(gòu)部分幾乎完全保守［14］。人和小鼠在蛋白質(zhì)水平有87%同源，除了第三個鋅指結(jié)構(gòu)中一個氨基酸置換外，其余鋅指結(jié)構(gòu)均保持一致，同時鋅指結(jié)構(gòu)之間的距離也是保守的［14］。

2 Wig-1的表達與調(diào)控

Wig-1的表達極為廣泛［7］，幾乎在所有檢測的組織中均有Wig-1表達，但在腦組織中表達水平最高，BioGPS(http://biogps．gnf．org)表達數(shù)據(jù)也證實Wig-1在所有組織表達基礎(chǔ)水平，在腦組織特別是在杏仁核和額葉前皮質(zhì)表達水平最高，在平滑肌、心肌細胞、脂肪細胞表達水平較高。

人Wig-1在內(nèi)含子1含有功能性的p53反應(yīng)元件，小鼠Wig-1啟動子區(qū)域內(nèi)包含2個功能性的p53結(jié)合位點，說明 p53 可以直接調(diào)節(jié) Wig-1［5，8］。3 個研究小組證實Wig-1是p53靶位基因［4-8］，芯片數(shù)據(jù)也顯示使用小分子RITA激活p53以后，Wig-1表達上調(diào)［15］。此外，使用化療藥物氟尿嘧啶處理造血干細胞后引起DNA損傷，也可誘導Wig-1表達，這些均證明 Wig-1受 p53的調(diào)控［16］。

但是，同樣也觀察到在缺乏p53的細胞中，Wig-1仍維持較高水平，說明p53并不是調(diào)節(jié)Wig-1表達的唯一轉(zhuǎn)錄因子。通過數(shù)據(jù)庫(pscan:http://159．149．109．9/pscan/和 genomatix:http://www．genomatix．de)搜索，根據(jù)搜索數(shù)據(jù)庫和搜索參數(shù)的不同，得到Wig-1啟動子區(qū)域包含45～130個假定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的結(jié)果，包括Myf5(myogenic factor 5)、FEV(fifth ewing variant，)、SPI1(spleen focus forming virus proviral integration oncogene)、Spz1(spermatogenic leucine zipper 1)、Pou5f1(POU class 5 homeobox 1)、GABPA(GA-binding protein alpha)、TP53、Nr2e3(nuclear receptor subfamily 2，group E，member 3)、Sox2(sex-determining region Y-box 2)、HLF(hepatic leukemia factor)等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，這表明Wig-1接受多種轉(zhuǎn)錄因子嚴密調(diào)控。根據(jù)Pscan預(yù)測，p53是人和小鼠Wig-1候選轉(zhuǎn)錄因子排名最靠前的，可結(jié)合到Wig-1啟動子區(qū)域，這和前面的實驗結(jié)果一致［4-7］。根據(jù)預(yù)測的Wig-1轉(zhuǎn)錄因子譜，發(fā)現(xiàn)Wig-1在多種組織(肌肉、大腦、晶狀體、造血干細胞、ES細胞)中表達，受到復(fù)雜的調(diào)節(jié)，這與檢測到Wig-1在多種組織廣泛表達一致。根據(jù)Pscan預(yù)測，發(fā)現(xiàn)Wig-1既能被抑瘤基因p53又能被一些促進細胞生長和具有癌基因特征的轉(zhuǎn)錄因子，如spz1、Pou5f1和SPI1激活，表明Wig-1可在不同的細胞環(huán)境下誘導表達。另外，Wig-1候選轉(zhuǎn)錄因子(如Pou5f1和Sox2)對ES細胞生存至關(guān)重要，說明Wig-1可能是ES細胞一個新的調(diào)節(jié)因子。

為進一步研究上游調(diào)節(jié)信號通路對Wig-1表達的調(diào)控，對調(diào)控Wig-1的候選轉(zhuǎn)錄因子進行基因功能分類(gene ontology classifications:http://www．pantherdb．org)分析，結(jié)果顯示這些轉(zhuǎn)錄因子參與了白細胞介素、胰島素/胰島素樣生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、血小板源性生長因子、氧化性應(yīng)激、Ras、Toll-受體、凋亡、Wnt、趨化因子和細胞因子介導的炎癥、p53調(diào)控環(huán)路等信號通路，表明Wig-1參與了多種細胞活動過程。這些轉(zhuǎn)錄因子與重要的促進生長的信號通路相關(guān)，還有些信號通路跟Wig-1在p53網(wǎng)絡(luò)中的作用一致，如氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡及p53反饋環(huán)路。根據(jù)以上信號通路分析發(fā)現(xiàn)，p53確實是Wig-1上游重要的激活子。總之，多種轉(zhuǎn)錄因子參與的信號可激活Wig-1，而不管p53表達與否，但是DNA損傷后Wig-1的表達需要有功能的p53。

3 Wig-1的功能

研究顯示，外源性表達Wig-1可長期抑制細胞生長，但不影響細胞周期分布和細胞死亡;而使用小干擾RNA降低Wig-1表達，也可導致細胞活性下降，這表明Wig-1表達過低或者過高都不利于細胞生長。使用質(zhì)譜分析法鑒定Wig-1相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)RNA解旋酶A(RNA helicase)和不均一核糖核酸核內(nèi)核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，hnRNPA2/B1)以依賴 RNA的方式結(jié)合到 Wig-1［17］，然而這兩個蛋白均為多功能RNA結(jié)合蛋白，因此很難從這些RNA依賴的相互作用中單獨鑒定Wig-1的功能。與hnRNPA2/B1調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性一樣，研究發(fā)現(xiàn)，Wig-1通過結(jié)合p53 mRNA的3'UTR的富含尿嘧啶(U)區(qū)，穩(wěn)定 p53 mRNA，正向調(diào)節(jié)p53 mRNA，形成正向調(diào)節(jié)反饋環(huán)路。AREs由AUUUA組成或者連續(xù)幾個U組成，富含U區(qū)是AREs元件的一個子類，出現(xiàn)在8%的轉(zhuǎn)錄組中特定mRNA的3'UTR［18］，調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性和翻譯，使這些基因的mRNA表達得到精細調(diào)控，包括可調(diào)節(jié)細胞生長或?qū)ν獠恳蜃幼鞒黾毎磻?yīng)的基因，如 c-Myc、N-Myc、細胞周期調(diào)節(jié)蛋白、干擾素、p53及 p21［19，20］。AREs一般是負向調(diào)節(jié)基因表達，通過增加脫腺苷化作用促進mRNA降解，脫腺苷作用是mRNA降解的第一步也是限速步驟，同時加快mRNA衰變。AREs也可以降低翻譯效率。大部分結(jié)合和調(diào)節(jié)AREs的因子通過促進mRNA降解和抑制翻譯負向調(diào)節(jié)靶位mRNA［21］。然而也有主要表現(xiàn)為正向調(diào)節(jié)作用的AREs，如廣泛表達的人抗原R，AREs調(diào)節(jié)子根據(jù)所結(jié)合的mRNA表現(xiàn)為正向或者負向調(diào)節(jié)作用［22］。

ARE結(jié)合蛋白(ARE-binding proteins，ARE-BPs)能在細胞水平調(diào)控多種mRNA，因此被認為是重要的調(diào)節(jié)點［20］。p53基因的3'UTR包含一個富含尿嘧啶U區(qū)域(連續(xù)18個U)和另一個ARE［23］，兩者均被幾個ARE-BPs調(diào)節(jié)。Wig-1結(jié)合到p53 mRNA，通過阻止mRNA脫腺苷作用穩(wěn)定mRNA［24］，這增加p53蛋白質(zhì)水平，增強p53對DNA損傷反應(yīng)。另有研究表明，抑制Wig-1同源類似物PAG608引起依賴p53的誘導細胞死亡作用減弱。大部分ARE-BPs調(diào)節(jié)多種mRNAs，研究也顯示W(wǎng)ig-1可以靶向除p53以外的其他包含ARE的mRNA。

4 Wig-1在腫瘤疾病、非腫瘤性疾病及干細胞中的研究

4．1 Wig-1與腫瘤 Wig-1在多種腫瘤細胞系及不同組織來源的原代細胞中均表達，但Wig-1在不同的腫瘤細胞系和腫瘤組織中表達水平不一致(來自http://biogps．gnf．org)。例如在 HCT116、SKOV-3、HT-29、HEK293、MCF7、T3M4、SN12C 表達降低;而在HeLa、HT1080、Jurkat、SHSY-5Y、U2OS、UACC62、SKMEL5、LNCAP表達升高。乳頭狀甲狀腺癌較正常組織表達升高，鱗狀細胞癌與正常組織表達差異不明顯，乳腺浸潤性導管癌及乳腺浸潤性小葉癌中表達均下降。

Wig-1位于染色體3q26．32區(qū)域，該區(qū)域在頭頸、乳腺、卵巢、宮頸、前列腺、食管、鼻咽、肺鱗狀細胞癌及急性髓細胞樣白血病中均有擴增，這表明Wig-1在這些腫瘤中也可能擴增，也有實驗證實Wig-1在肺癌中過表達［7］。然而，Wig-1所在的染色體區(qū)域也存在幾個腫瘤相關(guān)的基因，如端粒酶RNA元件和Bcl-6，所以Wig-1是單基因擴增還是作為伴隨基因共擴增仍需要進一步研究。此外，Wig-1能同時被腫瘤抑制基因(如p53)和具有癌基因活性的轉(zhuǎn)錄因子激活，研究中也發(fā)現(xiàn)過表達 Wig-1和降低Wig-1表達均可抑制細胞生長，而在腫瘤組織中Wig-1表達升高和降低均有報道，因此，就目前的研究還不足以界定Wig-1是抑瘤基因還是癌基因，需要深入研究Wig-1在腫瘤中的功能。

4．2 Wig-1與非腫瘤性疾病 研究發(fā)現(xiàn)，大鼠Wig-1的類似物PAG608在大鼠神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域均表達相對較高的水平，在局部缺血、使用甲基苯丙胺處理大鼠、肌萎縮性側(cè)索硬化癥模型的早期、Parkinson疾病模型，均可誘導Wig-1表達。另外也有研究顯示，PAG608在大腦處于應(yīng)激作用下發(fā)揮預(yù)凋亡(pro-apoptotic)功能。總的來說，Wig-1/PAG608可在神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)激反應(yīng)和病理條件下發(fā)揮作用。

4．3 Wig-1與干細胞 在干細胞中Wig-1表達升高。比較造血干細胞、神經(jīng)干細胞、ES細胞及與之相應(yīng)的分化細胞表達，研究發(fā)現(xiàn)Wig-1在三種干細胞中表達水平較分化細胞高表達［25］。Bmi-1是維持造血干細胞自我更新的一個必需因子，在缺失Bmi-1癌基因的造血干細胞，Wig-1表達上調(diào)［26］，與此同時伴隨成體造血干細胞丟失，這是由于Wig-1表達水平升高促進造血干細胞丟失，還是缺失Bmi-1后所發(fā)生的代償機制，這仍需進一步研究。此外，Wig-1在紅細胞生成過程中表達下調(diào)，這與Wig-1維持造血干細胞和造血祖細胞干性功能一致。

另外，生物芯片研究結(jié)果證實Wig-1在生殖細胞和ES細胞中發(fā)揮作用。例如，使用神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)元營養(yǎng)因子和神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)元營養(yǎng)因子家族受體α1刺激精原干細胞可誘導Wig-1表達［27］。這些研究表明，生長因子刺激干細胞以后誘導Wig-1表達。與Wig-1在干細胞中的作用一致，Wig-1在受精前的小鼠卵母細胞低水平表達，這種水平維持至E4．5胚胎表達升高。觀察到使用shRNA干擾Wig-1的表達以后，降低干細胞表型，表明Wig-1能維持胚胎干細胞干性［28］，生物信息學也預(yù)測Wig-1候選轉(zhuǎn)錄因子包含2個ES細胞必需轉(zhuǎn)錄因子Pou5f1和Sox2。

5 存在的問題

p53靶位基因Wig-1參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)，表明p53及其下游靶位Wig-1所參與一個全新的基因調(diào)節(jié)，p53除了直接轉(zhuǎn)錄靶位，還在mRNA水平調(diào)節(jié)不同的靶位［29］，p53通過調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性或者翻譯，精細調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄靶位。然而，仍需解決以下問題:鑒定Wig-1新的靶位及調(diào)控Wig-1的轉(zhuǎn)錄因子;確切闡明Wig-1功能及Wig-1發(fā)揮功能的具體機制，Wig-1是否能參與重編程，使成體細胞恢復(fù)干細胞特性;Wig-1在腫瘤干細胞中的表達如何?是否也參與維持腫瘤干細胞的自我更新和分化?只有解決這些問題才能全面闡明Wig-1在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達和細胞生物學功能。

6 結(jié)語

隨著研究的深入，越來越凸顯p53調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。p53有除細胞周期調(diào)控和應(yīng)激條件下誘導細胞凋亡功能以外，還有調(diào)節(jié)細胞新陳代謝的作用，低基礎(chǔ)水平的可促進細胞存活，p53靶位基因Wig-1正好具有這些功能，Wig-1誘導細胞周期阻滯或凋亡，并且在翻譯后水平調(diào)節(jié)基因表達。Wig-1在所有真核細胞生物結(jié)構(gòu)保守，因此Wig-1對維持細胞的基本活動和調(diào)控細胞命運具有重要作用。然而，Wig-1的功能及生物學意義的研究才剛剛起步，還需要更多、更深入的研究，才能完全闡明其功能和生物學意義。

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