Toll樣受體與肝纖維化關(guān)系的研究進(jìn)展

何志國(guó)(綜述)，趙永忠(審校)

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西桂林541001)

肝纖維化是指肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生，是一種“創(chuàng)傷愈合”的慢性漸進(jìn)性的病理過(guò)程。肝細(xì)胞損傷后，炎性反應(yīng)致白細(xì)胞聚集于炎癥病灶，釋放多種炎性細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、血小板衍生生長(zhǎng)因子等，這些炎性細(xì)胞因子再激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，釋放大量的細(xì)胞外基質(zhì)，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白，這就導(dǎo)致了一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的膠原沉積，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化［1，2］。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)跨膜受體，在肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制中具有重要作用［3］。TLRs在肝臟的庫(kù)普弗細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、HSC以及肝細(xì)胞等多種細(xì)胞上表達(dá)。研究表明，在肝免疫細(xì)胞和HSC上被激活的TLRs在肝纖維化形成過(guò)程中具有重要的作用［4］。

1 TLRs家族

1．1 TLRs及其配體 TLRs家族為固有免疫系統(tǒng)中的保守性膜受體，負(fù)責(zé)識(shí)別多種外源性和內(nèi)源性配體分子［5］。自1997年Medzhitov等鑒別并克隆出人的一種果蠅Toll同源受體以來(lái)，已有13種TLRs在哺乳動(dòng)物中被確定，人有10種，大鼠有12種［6］。其中 TLR1、2、4、5、6 和 10 表達(dá)于細(xì)胞表面，活化后遷移至吞噬溶酶體;TLR3、7、8、9表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)，主要位于細(xì)胞內(nèi)和胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。TLR是具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)的Ⅰ型跨膜形式識(shí)別受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞質(zhì)區(qū)三部分組成。胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列，為550～980個(gè)氨基酸組成;跨膜區(qū)為半胱氨酸;胞質(zhì)區(qū)存在一段序列保守區(qū)，該序列與白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1受體同源，由約200個(gè)氨基酸組成。雖然TLR家族具有相似的結(jié)構(gòu)，但不同的TLR能夠識(shí)別不同的配體。病原相關(guān)的TLR配體可分為 三 類(lèi):與 TLR2/TLR1、TLR2/TLR6、TLR4 結(jié)合的脂質(zhì)與脂質(zhì)蛋白;與TLR5結(jié)合的蛋白質(zhì);與TLR3、7、8、9 結(jié)合的核酸［7］。

1．2 TLRs表達(dá)及調(diào)控 TLRs活化一方面對(duì)微生物迅速作出反應(yīng)，同時(shí)觸發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答;另一方面也會(huì)因過(guò)量的細(xì)胞因子及抗原遞呈細(xì)胞的過(guò)度活化而導(dǎo)致疾病。有研究表明，機(jī)體可通過(guò)誘導(dǎo)負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制特異性干擾TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)TRLs表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，使機(jī)體避免免疫系統(tǒng)過(guò)度激活而導(dǎo)致?lián)p害［8］。其中包括:①誘導(dǎo)產(chǎn)生可溶性TLRs封閉膜表面TLRs與配體的結(jié)合。②細(xì)胞內(nèi)負(fù)性調(diào)節(jié)因子(如接頭蛋白髓樣細(xì)胞分化因子)和跨膜蛋白調(diào)節(jié)因子通過(guò)滅活TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的適配分子和酶封閉TLRs活化途徑。③泛素化誘導(dǎo)分子，如TLRAD3促進(jìn)的TLR降解。④TGF-β直接下調(diào)TLRs表達(dá)。⑤TLRs誘導(dǎo)的凋亡阻止過(guò)度炎性反應(yīng)等影響TLRs表達(dá)及功能［8］。

2 TLRs在肝纖維化中的作用

2．1 TLRs與HSC HSC位于肝竇Disse間隙內(nèi)，胞體呈卵圓形，形狀不規(guī)則，有數(shù)個(gè)星狀突起。正常情況下其主要功能是儲(chǔ)存和代謝維生素A。形態(tài)學(xué)上可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)數(shù)個(gè)富含維生素A和三酰甘油的脂滴。此外，HSC還分泌少量的細(xì)胞外基質(zhì)和一定量的基質(zhì)金屬蛋白酶。在肝損傷過(guò)程中HSC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化而激活成為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)肝纖維化的形成。業(yè)已證實(shí)，HSC激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。Paik等［9］發(fā)現(xiàn)活化的HSC表達(dá)TLR4和其輔助受體髓樣分化蛋白2和CD14。脂多糖可直接激活HSC，在激活的 HSC中存在完整的TLR4信號(hào)通路，脂多糖直接激活HSC表面的TLR4進(jìn)而激活核因子 κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)和c-Jun氨基末端激酶通路，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)。脂多糖同時(shí)還增強(qiáng)細(xì)胞間黏附分子1和血管細(xì)胞黏附分子1在細(xì)胞表面的表達(dá)，并誘導(dǎo)活化的HSC分泌趨化因子IL-8和單核趨化蛋白1。如果抑制NF-κB的活性，同時(shí)部分抑制c-Jun氨基末端激酶的活性，可以完全阻斷HSC分泌IL-8，這表明NF-κB和c-Jun氨基末端激酶在HSC的TLRs信號(hào)表達(dá)中起關(guān)鍵作用。資料顯示，TLR4可上調(diào)各類(lèi)趨化因子(單核趨化蛋白1、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1α、庫(kù)普弗細(xì)胞、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1β、調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2、干擾素誘導(dǎo)蛋白10)和TLR2的表達(dá)，而通過(guò)接頭蛋白髓樣細(xì)胞分化因子途徑和NF-κB途徑下調(diào)靜止的HSC的TGF-β仿真受體 Bambi(BMP and the activin memebrane-bound inhibitor)來(lái)增加TGF-β介導(dǎo)的HSC活化及其膠原的產(chǎn)生［10］。TLR3和TLR4的配體可通過(guò)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)接蛋白刺激 HSC 產(chǎn)生 TGF-β［11］，但 TLR3的配體可直接刺激HSC產(chǎn)生TGF-β，而TRL4的配體則無(wú)此功能，這提示HSC有不同于巨噬細(xì)胞的獨(dú)特通路即 TLR3/TLR4-TRIF［12］。

TLR9在HSC上也有表達(dá)。Watanabe等［13］已經(jīng)證實(shí)，來(lái)源于肝細(xì)胞凋亡的DNA分子通過(guò)TLR9信號(hào)通路誘導(dǎo)HSC的分化，隨著HSC內(nèi)的表達(dá)，TGF-β和Ⅰ型膠原纖維的mRNA水平升高，來(lái)源于肝細(xì)胞凋亡的DNA刺激HSC發(fā)生纖維化反應(yīng)。

2．2 TLR4與肝纖維化 TLR4加強(qiáng)HSC和庫(kù)普弗細(xì)胞間的相互作用，加強(qiáng)由TGF-β或者庫(kù)普弗細(xì)胞誘導(dǎo)的HSC的活化，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。TRL4突變小鼠比接受膽管結(jié)扎、長(zhǎng)期予四氯化碳(CCl4)，或硫代乙酰胺處理的TRL4野生型小鼠更少發(fā)生肝臟炎癥和纖維化［10］。缺乏CD14和脂多糖結(jié)合蛋白的小鼠也顯示膽汁性肝纖維化發(fā)生率降低［14］。乙醇喂養(yǎng)的小鼠血漿內(nèi)毒素水平顯著增加，可導(dǎo)致肝臟脂肪沉積、壞死和炎癥，肝臟受到損傷后，脂多糖水平在肝門(mén)脈系統(tǒng)和體循環(huán)系統(tǒng)也有明顯的增加［15］。在內(nèi)毒素作用下，一方面肝臟活化的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，伴隨氮氧化物合成酶2、環(huán)氧化酶2、微粒體前列腺素E合成酶1、IL-1和腫瘤壞死因子α基因的表達(dá);另一方面內(nèi)皮細(xì)胞也發(fā)生相同變化，產(chǎn)生細(xì)胞因子損害肝細(xì)胞。無(wú)論是巨噬細(xì)胞，還是內(nèi)皮細(xì)胞都通過(guò)TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1和NF-κB轉(zhuǎn)錄基因活化［16］。這些結(jié)論提示脂多糖與TLR4間的相互作用對(duì)肝纖維化的進(jìn)展具有重要作用。TLR4也可被內(nèi)源性配體激活，如高遷移率族蛋白B1、透明質(zhì)酸、熱休克蛋白60等［7，15］。但目前沒(méi)有強(qiáng)有力的證據(jù)表明內(nèi)源性TLR4配體與肝纖維化有相關(guān)性，還有待進(jìn)一步研究。

業(yè)已證實(shí)，庫(kù)普弗細(xì)胞是TLR4配體脂多糖的靶點(diǎn)，并產(chǎn)生各種炎性及纖維化細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可激活 HSC［17］。靜止和激活的 HSC都表達(dá)TLR4［9，10］。庫(kù)普弗細(xì)胞和 HSC 的 TLR4 在肝纖維化中的具體作用尚不清楚。但有研究顯示，膽總管結(jié)扎后，TLR4野生型肝臟細(xì)胞的小鼠出現(xiàn)明顯的肝纖維化，而TLR4突變型肝臟細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出肝纖維化顯著降低［10］。

2．3 TRL4和TGF-β在HSC的活化中的相互作用

TGF-β是強(qiáng)有力的纖維源性細(xì)胞因子。TGF-β可通過(guò)以下途徑促使肝纖維化的發(fā)生:①激活肝內(nèi)HSC，誘導(dǎo)膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生;②抑制基質(zhì)降解蛋白水解酶的合成，促進(jìn)肝內(nèi)膠原沉積;③調(diào)節(jié)HSC儲(chǔ)存維生素A的能力，進(jìn)而調(diào)節(jié)基質(zhì)產(chǎn)生;④抑制肝細(xì)胞內(nèi)DNA合成，并可作為調(diào)節(jié)信號(hào)阻止肝細(xì)胞再生。目前的研究顯示，HSC上的TLR4至少有兩種作用:①刺激HSC產(chǎn)生各種趨化因子和黏附分子(細(xì)胞間黏附分子1、血管細(xì)胞黏附分子1、E選擇素)，使庫(kù)普弗細(xì)胞和(或)循環(huán)巨噬細(xì)胞聚集到HSC所在部位，事實(shí)上，含脂多糖的HSC條件培養(yǎng)基可增加庫(kù)普弗細(xì)胞遷移和黏附［10］。②TLR4的活化會(huì)增強(qiáng)HSCs TGF-β信號(hào)表達(dá)。在膠原蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白(coll-GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠分離的HSC中，綠色熒光強(qiáng)度會(huì)隨膠原啟動(dòng)子活性增加而增強(qiáng)［18］。單獨(dú)用 TGF-β處理僅能使靜止的HSC膠原蛋白啟動(dòng)子活性輕度升高，而用脂多糖預(yù)處理可使TGF-β誘導(dǎo)的HSC膠原啟動(dòng)子活性進(jìn)一步增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，TLR4的信號(hào)增強(qiáng)了HSC的TGF-β信號(hào)［10］，而在庫(kù)普弗細(xì)胞上的TLR4對(duì)TLR-4介導(dǎo)的HSC的活化作用并不大，但庫(kù)普弗細(xì)胞作為T(mén)GF-β的重要來(lái)源是 HSC激活所必需的，因?yàn)門(mén)GF-β抑制劑處理的庫(kù)普弗細(xì)胞和HSC共培養(yǎng)，HSC活化完全停滯。綜上所述，在肝纖維化形成過(guò)程中，TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)HSC的激活起著關(guān)鍵作用。

2．4 TRL3與肝纖維化 TRL3識(shí)別雙鏈RNA，如多聚肌醇:胞嘧啶核苷酸(Ploy I:C)，誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素-Ⅰ和干擾素-Ⅱ，在由CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，給予TLR3的配體Ploy I:C治療可抑制肝纖維化的發(fā)生［19］。Ploy I:C抑制肝纖維化的發(fā)生是通過(guò)自然殺傷細(xì)胞和干擾素γ起作用的。自然殺傷細(xì)胞在Ploy I:C的刺激下對(duì)有活性的HSC產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，而對(duì)靜止的HSC無(wú)反應(yīng)。Ploy I:C直接或間接通過(guò)干擾素γ增強(qiáng)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體在自然殺傷細(xì)胞上的表達(dá)，增加自然殺傷細(xì)胞對(duì)活性HSC的細(xì)胞毒作用，抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步研究證實(shí)，依賴Ploy I:C抑制肝纖維化發(fā)生的自然殺傷細(xì)胞在接受乙醇處理的動(dòng)物中是被抑制的［20］。這些結(jié)果表明，依賴TLR3介導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞導(dǎo)致HSC的死亡減少，是酒精性肝病發(fā)生肝纖維化的潛在機(jī)制之一。

2．5 TLR9與肝纖維化 TLR9可識(shí)別細(xì)菌的非甲基化CpG-DNA［11］。研究證實(shí)，肝纖維化的進(jìn)展與腸道菌群的移位及其產(chǎn)物有關(guān)［10］。資料顯示，肝硬化患者和肝硬化大鼠的血漿及腹水中的細(xì)菌DNA水平均升高［21］。Watanabe 等［13］指出，在肝纖維化過(guò)程中，壞死肝細(xì)胞變性的DNA與TLR9結(jié)合后可刺激HSCs使肝纖維化加重，而經(jīng)膽總管結(jié)扎和CCl4慢性處理的TLR9基因缺陷大鼠肝纖維化程度則減輕［13，22］，提示細(xì)菌 DNA 和來(lái)源于機(jī)體凋亡細(xì)胞的DNA均可作為T(mén)LR9的配體，參與肝纖維化的進(jìn)展。Connolly等［23］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)表達(dá) TLR9和 CD11c細(xì)胞在肝纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。CD11c在樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)［24］。耗竭CD11c后的大鼠肝纖維化的發(fā)生率明顯降低，提示表達(dá)CD11c的非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中具有重要作用［23］。肝纖維化時(shí) CD11c細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α、IL-6和各種趨化因子的能力增強(qiáng)，在TLR9配體的作用下，這些因子反過(guò)來(lái)又刺激CD11c細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)，但以上現(xiàn)象不存在于正常肝組織中。CpGDNA介導(dǎo)肝纖維化中CD11c陽(yáng)性細(xì)胞的增加，自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括依賴腫瘤壞死因子α途徑干擾素γ的增加。CpG-DNA介導(dǎo)CD11c陽(yáng)性細(xì)胞誘導(dǎo)HSC增殖和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，如IL-1α、IL-6、單核趨化蛋白1。這項(xiàng)研究顯示，TLR9和CD11c陽(yáng)性細(xì)胞在肝纖維化中有重要作用。然而，關(guān)于樹(shù)突狀細(xì)胞在肝纖維化中的作用還未完全清楚，需要更進(jìn)一步的研究來(lái)闡明。

3 結(jié)語(yǔ)

目前認(rèn)為，肝纖維化的發(fā)生是繼發(fā)于肝臟炎癥或細(xì)胞損傷后的修復(fù)反應(yīng)，幾乎所有的慢性肝臟損害的患者均可發(fā)生。近年來(lái)，TLRs在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但目前仍有許多問(wèn)題需要解決，雖然內(nèi)毒素血癥可促進(jìn)肝纖維化發(fā)生、發(fā)展已日漸明確，但內(nèi)毒素如何通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)導(dǎo)致此效應(yīng)機(jī)制仍不清楚。盡管其中的詳盡機(jī)制并未完全明了，但對(duì)其分子機(jī)制的進(jìn)一步研究無(wú)疑將為臨床上肝纖維化的防治提供新的策略。

［1］ Bataller R，Brenner DA．Liver fibrosis［J］．J Clin Invest，2005，115(2):209-218．

［2］ Friedman SL．Mechanisms of hepatic fibrogenesis［J］．Gastroenterology，2008，134(6):1655-1669．

［3］ Beutler B．Inferences，questions and possibilities in Toll-like receptor signaling［J］．Nature，2004，430(6996):257-263．

［4］ 戴立里，龔建平，羅云，等．內(nèi)毒素血癥時(shí)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞脂多糖受體CD14蛋白表達(dá)的觀察［J］．中華肝臟病雜志，2002，10(2):93-96．

［5］ Katsargyris A，Klonaris C，Alexandrou A，et al．Toll-like receptors in liver ischemia reperfusion injury:a novel target for therapeutic modulation?［J］．Expert Opin Ther Targets，2009，13(4):427-442．

［6］ Beutler B．The toll-like receptors:analysis by forward genetic methods［J］．Immunogenetics，2005，57(6):385-392．

［7］ Akira S，Uematsu S，Takeuchi O．Pathogen recognition and innate immunity［J］．Cell，2006，124(4):783-801．

［8］ Liew FY，Xu D，Brint EK，et al．Negative regulation of toll-like peceptor-mediated immune responses［J］．Nat Rev Immunol，2005，5(6):446-458．

［9］ Paik YH，Schwabe RF，Bataller R，et al．Toll-like receptor 4 mediates inflammatory signaling by bacterial lipopolysaccharide in human hepatic stellate cells［J］．Hepatology，2003，37(5):1043-1055．

［10］ Seki E，De Minicis S，Osterricher CH，et al．TLR4 enhances TGF-beta signaling and hepatic fibrosis［J］．Nat Med，2007，13(11):1324-1332．

［11］ Takeda K，Akira S．Toll-like receptors in innate immunity［J］．Int Immunol，2005，17(1):1-14．

［12］ Wang B，Trippler M，Pei P，et al．Toll-like receptor activated human and murine hepatic stellate cells are potent regulators of hepatitis C virus replication［J］．J Hepatol，2009，51(6):1037-1045．

［13］ Watanabe A，Hashmi A，Gomes DA，et al．Apoptotic hepatocyte DNA inhibits hepatic stellate cell chemotaxis via toll-like receptor 9［J］．Hepatology，2007，46(5):1509-1518．

［14］ Isayama F，Hines IN，Kremer M，et al．LPS signaling enhances hepatic fibrogenesis caused by experimental cholestasis in mice［J］．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006，290(6):G1318-G1328．

［15］ Schwabe RF，Seki E，Brenner DA．Toll-like receptor signaling in the liver［J］．Gastroenterology，2006，130(6):1886-1900．

［16］ Chen LC，Gordon RE，Laskin DL，et al．Role of TLR-4 in liver macrophage and endothelial cell responsiveness during acute endotoxemia［J］．Exp Mol Pathol，2007，83(3):311-326．

［17］ Seki E，Brenner DA．Toll-like receptors and adaptor molecules in liver disease:update［J］．Hepatology，2008，48(1):322-335．

［18］ Magness ST，Bataller R，Yang L，et al．A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations［J］．Hepatology，2004，40(5):1151-1159．

［19］ Radaeva S，Sun R，Jaruga B，et al．Natural killer cells ameliorate liver fibrosis by killing activated stellate cells in NKG2D-dependent and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-dependent manners［J］．Gastroenterology，2006，130(2):435-452．

［20］ Jeong WI，Park O，Gao B．Abrogation of the antifibrotic effects of natural killer cells/interferon-gamma contributes to alcohol acceleration of liver fibrosis［J］．Gastroenterology，2008，134(1):248-258．

［21］ Guarner C，González-Navajas JM，Sánchez E，et al．The detection of bacterial DNA in blood of rats with CCl4-induced cirrhosis with ascites represents episodes of bacterial translocation［J］．Hepatology，2006，44(3):633-639．

［22］ G?bele E，Mühlbauer M，Dorn C，et al．Role of TLR9 in hepatic stellate cells and experimental liver fibrosis［J］．Biochem Biophys Res Commun，2008，376(2):271-276．

［23］ Connolly MK，Bedrosian AS．In liver fibrosis，dendritic cells govern hepatic inflammation in mice via TNF-alpha［J］．J Clil Invest，2009，119(11):3213-3225．

［24］ Aloman C，Tacke F．Dendritic cells in liver fibrosis:conductor of the inflammatory orchestra?［J］．Hepatology，2010，51(3):1070-1072．