生存素在腫瘤中的研究進展

徐淑梅，劉卓剛

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液科，沈陽 110021)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多步驟的生物學(xué)過程，一方面與細胞增殖的基因過度表達及分化調(diào)控紊亂有關(guān)，另一方面與調(diào)控細胞凋亡的基因異常有關(guān)。近年來，細胞凋亡與腫瘤關(guān)系成為研究的熱門課題，生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族的成員，廣泛表達于人的胚胎組織和多數(shù)腫瘤組織，具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞有絲分裂的生物學(xué)功能，是聯(lián)系細胞周期和細胞凋亡的重要因子。筆者就生存素的分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能、生存素與腫瘤表達、生存素與癌基因、生存素與腫瘤治療的研究進展作一綜述。

1 生存素的分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

1.1 生存素的分子結(jié)構(gòu) 生存素基因是AMBROSINI等［1］用效應(yīng)細胞蛋白酶受體-1(effector cell prorease recetpor-1，EPR-1)cDNA在人類基因組庫的雜交篩選中分離出來，是IAP家族相對分子質(zhì)量最小的成員，位于染色體17q25，全長14.7 kb。生存素基因包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，編碼142個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量為16 500的蛋白質(zhì)。生存素具有獨特的蝶形領(lǐng)結(jié)樣結(jié)構(gòu)，僅含一個桿狀病毒 IAP重復(fù)序列(baculoviral IAP repeat，BIR)，位于生存素氨基端，為生存素發(fā)揮細胞凋亡作用所必需。羧基端不含有鋅指狀結(jié)構(gòu)，而代之以一個含有42個氨基酸形成的α-螺旋結(jié)構(gòu)。生存素的前體mRNA經(jīng)過選擇性拼接可產(chǎn)生不同的剪接變構(gòu)體，具有不同的抗凋亡特性，一種是缺乏外顯子3的生存素(生存素-ΔEx3)，另一種是保留了部分內(nèi)含子2作為隱性外顯子的生存素(生存素-2B)。生存素-ΔEx3保留抗凋亡特性，而生存素-2B的抗凋亡能力明顯降低。

細胞周期依賴元件(cell-cycle dependent element，CDE)和細胞周期同源性區(qū)域(cell-cycle genes homology region，CHR)特異性存在于G2/M期表達基因。生存素基因在2 811 bp處有一個開放閱讀框，基因上游2 560～2 920 bp是生存素基因的啟動子，缺少TATA盒，富含GC，有3個CDE和1個CHR。生存素在G2/M期的表達可克服凋亡的“關(guān)卡”，通過有絲分裂促進細胞的異常增殖，提示生存素主要是G2/M期的調(diào)節(jié)基因。

1.2 生存素的生物學(xué)功能 細胞凋亡主要是通過效應(yīng)蛋白酶(Caspase)來實現(xiàn)的，體外實驗證明，生存素可特異結(jié)合于細胞凋亡蛋白酶的終末階段分子Caspase-3、Caspase-7［2］，發(fā)揮抑制凋亡的作用。腫瘤細胞表達生存素不僅可以阻斷Fas介導(dǎo)的凋亡信號途徑來逃避免疫細胞的殺傷，如細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和自然殺傷(natural killer，NK)細胞，而且可以通過增強Fas配體的表達反過來抑制免疫細胞的殺傷作用［3］。生存素的磷酸化修飾是決定其功能的重要因素。生存素的磷酸化位點是34位的蘇氨酸(threonine 34，Thr34)，在有絲分裂前、中期，生存素與有絲分裂激酶P34 cdc2-CyclinB1在裝配體上形成復(fù)合體并被其在Thr34上磷酸化，Thr34磷酸化的生存素與 Caspase-9形成生存素/Caspase-9復(fù)合體發(fā)揮抗凋亡作用，而Thr34非磷酸化導(dǎo)致生存素/Caspase-9復(fù)合體從裝配體上解離，釋放出Caspase-9導(dǎo)致細胞凋亡。生存素還可以通過與Smac/DIABLO(即第2個線粒體來源的胱氨酸酶激活劑或低等電點IAP直接結(jié)合蛋白)作用，使XIAP活性增加，XIAP直接與Caspases結(jié)合達到抑制凋亡的作用;通過抑制p53、p21的功能阻斷凋亡過程［4］。

生存素不但具有抑制細胞凋亡的作用，而且參與細胞有絲分裂的調(diào)節(jié)和細胞質(zhì)分裂。有絲分裂初期，生存素與有絲分裂紡錘體微管蛋白特異性結(jié)合，抑制Caspase活性，降低凋亡的發(fā)生，維護有絲分裂的正常進行。干擾生存素和微管蛋白的反應(yīng)，可使生存素抗凋亡活性喪失，增加Caspase-3的活性，導(dǎo)致細胞的G2/M期凋亡，細胞分裂異常，伴有多倍體細胞形成。在細胞周期的G2/M期，生存素能對抗異常因素誘導(dǎo)的細胞凋亡，而腫瘤細胞生存素的過度表達，能使細胞克服這個凋亡的調(diào)控點而利于轉(zhuǎn)化細胞，完成異常的有絲分裂。生存素也可與p21蛋白結(jié)合于中心粒上，使p21聚集在中心粒上，減弱p21對細胞周期的負性調(diào)節(jié)，使細胞周期縮短［4］。

研究顯示，生存素還參與血管形成過程，應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(buck fibroblast growth factor，bFGF)誘導(dǎo)靜止期的內(nèi)皮細胞，結(jié)果血管內(nèi)皮細胞內(nèi)生存素含量升高16倍，6～10 h達峰值，24 h開始下降。炎癥因子、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和白細胞介素(interleukin，IL)-1未能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞內(nèi)生存素的表達，提示生存素可能是血管形成中生長因子誘導(dǎo)的保護性基因，維持血管內(nèi)皮細胞的正常增殖。

2 生存素與腫瘤表達

生存素主要分布于胚胎及分化未成熟的組織中，在成人體內(nèi)除胸腺、甲狀腺、子宮內(nèi)膜組織、生殖腺中有微量表達外，所有分化成熟的組織，包括外周血白細胞、淋巴結(jié)、脾、胰、腎、骨骼肌、肝、肺、腦以及心臟組織中均無表達。很多實體瘤和造血系統(tǒng)惡性腫瘤中都檢測到生存素的高表達，且表達陽性患者的生存率相對陰性患者明顯降低，復(fù)發(fā)率則升高，與預(yù)后密切相關(guān)。體外實驗在多種腫瘤細胞系中也檢測到生存素的高表達。美國國立癌癥研究中心使用的60種腫瘤細胞系的檢測結(jié)果顯示［2］:生存素在60種腫瘤細胞系中普遍高表達，包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、肝癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤等，其中在乳腺癌及肺癌表達最高，腎癌表達最低。

3 生存素與癌基因

3.1 生存素與p53 野生型p53是生存素的負調(diào)控基因，能夠結(jié)合在生存素啟動子上，從而抑制生存素的轉(zhuǎn)錄，推測在生存素啟動子上可能存在p53基因結(jié)合位點，生存素參與了p53依賴性凋亡通路［5］。p53是bcl-2的上游調(diào)控基因，在正常情況下，野生型p53可以在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)bcl-2，促使細胞發(fā)生凋亡，bcl-2水平的下調(diào)直接或間接的影響了生存素的表達［6］。

3.2 生存素與bcl-2 bcl-2是重要的細胞凋亡調(diào)節(jié)因子，通過對抗引起線粒體破裂的離子失衡，阻斷細胞色素C從線粒體向細胞質(zhì)釋放，在Caspase級聯(lián)反應(yīng)上游防止其活化，保持線粒體完整性。生存素主要是抑制Caspase-3和Caspase-7的活性，與bcl-2都可在線粒體水平參與抗凋亡，并具有協(xié)同性。此外，生存素基因與bcl-2基因都是由TATA的富含GC啟動子調(diào)節(jié)的［注:T為胸腺嘧啶(thymine)，A為腺嘌呤(adenine)，G為鳥嘌呤(guanine)，C為胞嘧啶(cytosine)］，轉(zhuǎn)錄激活后均能增強細胞增殖，生存素基因所在的17q25染色體不穩(wěn)定，此位點可能涉及t(14;18)易位而導(dǎo)致bcl-2基因轉(zhuǎn)錄激活。ANGILERI等［7］對神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗凋亡基因的研究中發(fā)現(xiàn)，8例低級星形細胞瘤中生存素與bcl-2都是高表達，證實二者抗凋亡的協(xié)同性。

3.3 生存素與Bax Bax基因?qū)俚蛲龌罨?，轉(zhuǎn)染Bax基因能修飾腫瘤細胞的惡性表型，Bax基因突變存在于多種惡性腫瘤，提示Bax基因也屬抑癌基因。研究發(fā)現(xiàn)，將Bax基因與生存素基因協(xié)同轉(zhuǎn)染腫瘤細胞系，其共同誘導(dǎo)的細胞凋亡比單純Bax基因轉(zhuǎn)染減少1/3，表明生存素基因可拮抗Bax基因的促細胞凋亡作用［7］。Bax過度表達誘發(fā)線粒體釋放細胞色素C，激活Caspase-9，Caspase-9又激活下游的 Caspase-3和Caspase-7。生存素可以影響B(tài)ax的表達，阻滯由Bax介導(dǎo)的細胞色素C向細胞質(zhì)釋放，從而抑制細胞凋亡［8］。

3.4 生存素與磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN) 生存素與PTEN均參與細胞周期調(diào)控和細胞凋亡，兩者作用環(huán)節(jié)一致，但生物學(xué)效應(yīng)相反。研究發(fā)現(xiàn)，生存素與PTEN在腫瘤中的表達可能存在負性相關(guān)，腫瘤惡性程度越高，生存素基因表達越高，而PTEN表達越低。推測其機制是生存素的表達受PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控，而PTEN在正常生理情況下抑制PI3K/Akt通路，從而抑制生存素的表達。當(dāng)組織發(fā)生惡變，PTEN表達下調(diào)或缺失時，其對PI3K/Akt通路的抑制作用削弱，生存素表達上調(diào)［6］。生存素基因沉默和PTEN介導(dǎo)的腫瘤抑制密切相關(guān)［9］。

4 生存素與腫瘤治療

生存素表達水平下調(diào)可以直接調(diào)節(jié)腫瘤細胞自身凋亡，增加腫瘤細胞對化療或放療敏感性，增強化療或放療等對腫瘤細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。生存素成為腫瘤治療的關(guān)鍵靶點。

4.1 反義技術(shù) 應(yīng)用反義策略阻斷生存素表達，可明顯抑制腫瘤細胞的增殖，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，而對正常組織幾乎沒有不良影響，具有良好的靶向性、特異性和安全性。

4.1.1 反義寡核苷酸 OLIE等［10］設(shè)計了針對生存素mRNA不同區(qū)域的反義寡核苷酸，其中針對生存素的mRNA232～251 bp位置的反義寡核苷酸最有效，可使生存素的mRNA表達減少70%，并且治療后的腫瘤對化療的敏感性增加。反義介導(dǎo)的生存素基因敲除使得腫瘤細胞增殖明顯受抑，反義寡核苷酸藥物L(fēng)Y2181308已進入臨床試驗階段。SPC3042通過下調(diào)生存素的表達，抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡，并同時能下調(diào)bcl-2的表達，具有更強的穩(wěn)定性和抑制作用［11］。

4.1.2 核酶 靶向生存素的核酶載體轉(zhuǎn)染后能使生存素表達下降。CHOI等［12］設(shè)計了針對生存素mRNA 279 bp和289 bp位置，能夠特異降解生存素mRNA的兩個棒狀核酶(hammerhead ribozymes)，通過重組腺病毒導(dǎo)入乳腺癌細胞(MCF27)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入的核酶能夠有效降低生存素的表達，促進依托泊苷用藥后的凋亡。PENNATI等［13］構(gòu)建了表達靶向生存素的核酶載體，轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞DU145、PC3，穩(wěn)定表達核酶的細胞較對照前列腺細胞生存素的表達量明顯下降，并出現(xiàn)多倍體表型、Caspase-9依賴的凋亡，生存素表達的下調(diào)還導(dǎo)致前列腺癌細胞對順鉑的增敏，抑制接種于裸鼠的前列腺癌細胞形成腫瘤。

4.2 基因治療 主要包括2種方法:一種是生存素顯性失活突變體，將占優(yōu)勢的生存素顯性失活突變體導(dǎo)入腫瘤細胞后，減少內(nèi)源性生存素的表達，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制細胞增殖。MESRI等［14］將含生存素突變體 T34A的腺病毒載體(Pad-T34A)注射到SCID小鼠體內(nèi)的移植性人乳腺癌瘤體內(nèi)，觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞增殖明顯受抑，通過轉(zhuǎn)染生存素(Pad-T34A)能誘導(dǎo)HeLa細胞等5種腫瘤細胞凋亡，而對正常增生活躍的組織細胞(纖維母細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞)則無影響，結(jié)果證明生存素(Pad-T34A)可在體內(nèi)和體外誘發(fā)凋亡。另一種是基于生存素基因啟動子來促使腫瘤細胞中細胞毒基因表達。

4.3 小分子抑制劑

4.3.1 CDK抑制劑 cdc-2激酶抑制劑通過阻斷cdc-2對生存素的磷酸化作用，可以抑制腫瘤生長和誘導(dǎo)凋亡。目前名為flavorpividol的藥物己用于臨床。

4.3.2 Hps90抑制劑 生存素的氨基酸序列賴氨酸(lysine，Lys)-7-Lys-90能與分子伴侶Hps90氨基末端結(jié)合，利于生存素穩(wěn)定表達，目前普遍認為Hps90抑制劑，如17-AAG、shepherdin，能夠下調(diào)生存素，起到靶向腫瘤治療作用。Shepherdin能穿透細胞結(jié)合于Hps 90和生存素之間，占據(jù)ATP結(jié)合位點，松動client蛋白，啟動凋亡途徑和非凋亡途徑致腫瘤細胞大量死亡;此外，shepherdin不會影響正常細胞活力和造血祖細胞的克隆形成能力。最近有研究報道，17-AAG能抑制與生存素負相關(guān)的26s蛋白酶體活性，反而使腫瘤細胞生存素的過表達，所以通過Hps90來抑制生存素表達還有待進一步探索［15］。

4.3.3 YM155 YM155可以誘導(dǎo)腫瘤細胞生存素表達的下調(diào)，有濃度-時間依賴性，能增加實體瘤對放療的敏感性。YM155具有更強的抗腫瘤活性，是因為YM155用藥后在腫瘤組織中的濃度比血漿中明顯高，已進入臨床實體瘤的試驗治療階段［16］。

4.3.4 其他小分子抑制劑 研究證明其他小分子抑制劑也能間接抑制生存素的表達，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄活化子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)和T-cell factor的拮抗劑可以抑制生存素的轉(zhuǎn)錄，Erb B2的拮抗劑拉帕替尼(lapatinib)通過加速泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解抑制生存素表達。

4.4 靶向生存素的RNA干涉 RNA干涉(RNA interferencing，RNAi)能使生存素基因沉默，具有高度的特異性、穩(wěn)定性、穿透性。SHEN等［17］通過構(gòu)建干擾生存素的小發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)的表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染生存素高表達的胰腺癌細胞Patu8988。結(jié)果證明，生存素mRNA和蛋白均明顯下降，并抑制Patu8988細胞增殖。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的能力有限，YAN等［18］構(gòu)建腺病毒表達載體的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，轉(zhuǎn)染肝癌細胞HepG2后，生存素mRNA與蛋白表達下降率分別為72.34%和66.32%，說明構(gòu)建腺病毒表達siRNA的表達系統(tǒng)有利于基因功能的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療。靶向生存素的siRNA不僅能下調(diào)生存素的表達，還能增加腫瘤細胞對化療的敏感性，通過抑制肺抗性相關(guān)蛋白(lung resistance related protein，LRP)逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥［19］。

4.5 免疫治療 近年發(fā)現(xiàn)生存素在腫瘤免疫治療中同樣起著重要作用，能使被之修飾的樹突狀細胞等免疫細胞具有腫瘤組織靶向性。從生存素蛋白中分離出的人類白細胞抗原復(fù)合物A2亞型(HLA-A2)結(jié)合肽具有誘導(dǎo)腫瘤患者特異性T細胞免疫的功能。生存素誘導(dǎo)的CTL細胞能特異性殺傷表達陽性的腫瘤細胞，使其成為T細胞免疫的靶點，為腫瘤的免疫治療提供了新策略［20］。

4.6 其他 生存素在細胞有絲分裂初期與紡錘體微管蛋白特異性結(jié)合，從而干擾和微管蛋白的反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡，抗微管藥物如長春新堿也可間接抑制生存素。

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