雷氏大疣蛛粗毒對DRG細胞上鈉鉀鈣離子通道的影響

王小娟，朱陽慧，劉中華

（湖南師范大學生命科學學院，蛋白質組學與發(fā)育生物學教育部重點實驗室，中國長沙 410081）

雷氏大疣蛛粗毒對DRG細胞上鈉鉀鈣離子通道的影響

王小娟，朱陽慧，劉中華*

（湖南師范大學生命科學學院，蛋白質組學與發(fā)育生物學教育部重點實驗室，中國長沙 410081）

采用全細胞記錄（whole-cell recording）模式膜片鉗技術在大鼠背根神經節(jié)細胞（dorsal root ganglia，DRG）上檢測了雷氏大疣蛛粗毒對電壓門控鈉通道、鉀通道及鈣通道的影響．結果表明，雷氏大疣蛛粗毒對TTX-R型鈉電流、電壓門控鉀電流以及鈣電流均無明顯作用，但對TTX-S型鈉電流表現(xiàn)出較強的濃度依賴性抑制效應，半有效抑制濃度（IC50）為11．04 mg/L．100 mg/L雷氏大疣蛛粗毒對DRG細胞TTX敏感性鈉電流的電壓-電流（I-V）曲線的激活閾值和逆轉電位均有近－10 mV的漂移作用，并使穩(wěn)態(tài)失活曲線向超極化方向漂移15 mV左右，但并不影響失活曲線的常數k．

雷氏大疣蛛;粗毒;大鼠背根神經節(jié)（DRG）;全細胞膜片鉗;河豚毒素敏感型鈉通道

雷氏大疣蛛（Macrothele raveni）［1］是最近在我國廣西壯族自治區(qū)寧明縣境內發(fā)現(xiàn)并由河北大學朱明生教授定名的異仿蛛科大疣蛛屬新種，大部分生活于熱帶和亞熱帶，其粗毒中含有多種生物活性成分，可使昆蟲及小型脊椎動物致死．有毒動物分泌的毒液所含的成分十分復雜，根據相對分子質量大小可分為3類:小分子無機物或有機物（＜1 000）、多肽類（1 000─10 000）和蛋白質類（＞10 000）［2］．本研究室通過膜片鉗技術和電壓鉗技術研究發(fā)現(xiàn)，很多蜘蛛毒素具有毒性是由于它們作用于細胞膜表面的離子通道，是多種離子通道受體，長期以來本實驗室在蜘蛛毒素研究方面主要集中于神經毒素研究．

很多蜘蛛粗毒中含有對哺乳動物及昆蟲神經系統(tǒng)有阻斷作用的活性成分，如對鈉通道的影響可抑制神經系統(tǒng)興奮傳導．肖玉成等人［3］發(fā)現(xiàn)雷氏大疣蛛粗毒對NG10-15細胞上的電壓門控鈉通道有阻斷作用，但目前還未報道從雷氏大疣蛛粗毒中分離純化出對鈉通道具有阻斷活性的毒素分子．曾雄智等人從雷氏大疣蛛粗毒中純化得到雷氏大疣蛛毒素-Ⅱ［4］和雷氏大疣蛛毒素-Ⅵ［5］，這兩種毒素經實驗表明都是神經毒素肽，但不具有離子通道活性．

另外，雷氏大疣蛛粗毒還具有其他生物學活性．Jackson T［6］等人發(fā)現(xiàn)雷氏大疣蛛粗毒含有纖溶酶活性，具有較好的纖溶作用．還有研究表明，雷氏大疣蛛粗毒對肝癌細胞的增殖具有抑制作用［7］，對于腫瘤細胞株Hela［8］和HepG2［9］的生長具有較為明顯的抑制作用，這說明雷氏大疣蛛粗毒中很可能含有細胞毒活性成分．

本研究通過在大鼠背根神經節(jié)（DRG）細胞上進行膜片鉗全細胞記錄實驗，研究雷氏大疣蛛粗毒對電壓門控鈉、鉀、鈣通道的影響，進行了初步生物學活性鑒定，發(fā)現(xiàn)毒素對TTX-S型鈉通道具有明顯的阻斷作用，并對這種阻斷作用進行了較為深入的研究和分析．

1 材料和方法

1．1 粗毒和動物

雷氏大疣蛛粗毒購自廣西南寧市南方蜘蛛研究所．

SD大鼠（即Sprague-Dawley品系大白鼠）購買自湖南農業(yè)大學并在本實驗室動物房短期飼養(yǎng)．

1．2 實驗儀器

膜片鉗研究用倒置顯微鏡OlympusⅨ70;PC-10型電極拉制儀為Narishige產品;膜片鉗加藥用微量注射器為Narishige IM-5B型．使用EPC-10膜片鉗放大器（HEKA，國產），該放大器由PC機下運行的Pulse+pulsefit8．0軟件控制（HEKA，Germany），內置于EPC-10中的ITC-16多功能數據采集卡（Instrutech，USA）控制接口和數據的采集和記錄．

1．3 溶液配制

DRG細胞培養(yǎng)液:稱取DMEM干粉346 mg+NaHCO374 mg，溶于20 mL雙蒸水后，用1 mol/L NaOH調pH至7．4，如DMEM中不含HEPES，則需按2∶1的物質的量之比加入．溶液配好后用99．9%的氧氣飽和10 min左右，溶液顏色變?yōu)槌燃t色即可，并于36℃水浴預熱備用．

消化液:膠原酶（Collagenase IA 1．56 mg）+胰蛋白酶（Trypsin 0．66 mg），用上述充氧飽和的DMEM培養(yǎng)液5 mL溶解后于36℃預熱備用．

消化抑制劑:胰蛋白酶抑制劑（Zn-inhibitor，1．2 mg）．

記錄鈉通道的電極內液為（mmol/L）:CsF 135，NaCl 10，HEPES 5．用1 mol/L CsOH和HCl將pH值調至7．0．

細胞外液為（mmol/L）:NaCl 30，MgCl21，CaCl21．8，CsCl 5，KCl 5，D-glucose 25，HEPES 5，Triethanolamine Chlorine（TEA-Cl）20，Tetramethylammonium Chloride 70．用1 mol/L TEA-OH將pH值調至7．4．

記錄鉀通道的電極內液為（mmol/L）:KF 120，NMG 20，EGTA 10，MgATP 2，GTP 0．5，HEPES 10．用1 mol/L KOH將pH值調至7．4．

細胞外液為（mmol/L）:choline chloride 130，KOH 5，HEPES 10，D-glucose 12，MgCl22，CaCl22．用1 mol/L KOH將pH值調至7．4．

記錄鈣通道的電極內液為（mmol/L）:CsCH3SO3108，MgCl24，EGTA 9，HEPES 9，MgATP 3．6，creatine kinase（50 units/mL）．用1 mol/L CsOH將pH值調至7．4．

細胞外液為（mmol/L）;BaCl25，tetraethylammonium chloride 160，EGTA 0．1，HEPES 10．用1 mol/L TEAOH將pH值調至7．4．

DMEM干粉、膠原酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑均購自Sigma公司．

1．4 大鼠背根神經節(jié)細胞急性分離和培養(yǎng)

取體重180～200 g的SD大白鼠，雌雄不拘，斷頸處死后，用手術剪迅速取出脊椎剪至胸腰椎段，剪成2～3段，再沿與肋骨平面垂直的方向將椎管剪開，放入盛有少許DMEM培養(yǎng)液的小燒杯中浸泡．用尖頭鑷子剝除脊髓，并撕去附著在椎管內壁上的一層粘膜，暴露位于椎孔的背根神經纖維，挑取10～20個左右并放入盛有2 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中．用維納斯剪和尖頭鑷子分離出神經節(jié)，切除包在節(jié)外的絮狀物和軸索后，放入盛有0．5 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中．用吸管吸去培養(yǎng)液，將分離好的所有神經節(jié)用維納斯剪剪碎（剪碎時間5～8 min為宜），越碎越好．之后轉入消化液中于36℃，200 r/min環(huán)境中酶解20～25 min，期間每隔7～8 min用1 mLTip頭吹打均勻．于消化液中加入酶的抑制劑，終止酶解反應．轉入15 mL離心管中進行離心（1 000 r/min，3 min），棄上清，加入體積分數為5%的小牛血清培養(yǎng)液．重懸細胞后分裝于2～3個35 mm培養(yǎng)皿中（事先鋪一層多聚賴氨酸促進貼壁），再放入培養(yǎng)箱（VCO2∶V空氣=1∶19）中培養(yǎng)3 h貼壁．貼壁后的DRG細胞有球形和橢球形兩種，并帶有一或長或短的軸突，質膜光滑可見，胞質均勻．DRG細胞的急性分離受外界條件的干擾較嚴重，如環(huán)境溫度、季節(jié)、酶的濃度、消化時間等，故在實驗過程中應隨時注意調整幾種酶的量與消化時間，以達最佳分離效果．

1．5 膜片鉗全細胞記錄

實驗前先將1．5 mL恢復至室溫的細胞外液更換培養(yǎng)皿內的組織培養(yǎng)液，實驗在20～25℃室溫條件下進行．注意換液時一定要格外小心，液流速度不能過快，防止貼壁的細胞從培養(yǎng)皿底部脫落而懸浮于液面上．

首先將細胞置于倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，選擇質膜光滑可見、胞質均勻且不與其他細胞重疊的健康細胞作為實驗細胞．與膜片鉗放大器相連的電極銀絲在實驗前進行AgCl泛極化處理，避免銀絲與電極內液、細胞外液發(fā)生離子交換產生Ag+．參考電極與細胞外液之間用150 mmol/L NaCl-瓊脂鹽橋與細胞外液相連，瓊脂鹽橋可以防止參考電極NaCl溶液進入細胞外液而改變細胞周圍的離子濃度．硼硅酸鹽玻璃毛細管（100 μL，VWR company，USA）在電極拉制儀（PC-10，Narishige）上經兩步拉制而成尖端口徑為1．5～2．0 μm的鉗制玻璃電極．鉗制電極充灌細胞內液后用注射器加入少許正壓然后入水，一般入水后所測電阻為1．5～2．5 MΩ為佳，隨后補償消除電極液與細胞外液之間的液結電位（LJ）．當調動微操讓電極不斷靠近細胞時，電極電阻會逐漸增大，當增大0．2 MΩ時，停止電極繼續(xù)靠近細胞并釋放正壓，然后輕輕給予一負壓，電極與細胞膜之間就可形成吉歐（GΩ）封接．補償消除電極快電容（fastcapacitance）．將細胞膜電位鉗制在－60 mV，繼續(xù)給予負壓，將電極鉗制的那小塊細胞膜吸破．補償消除細胞慢電容（Slow capacitance）．形成全細胞記錄模式后，把細胞電位鉗制在－80 mV并穩(wěn)定4～6 min，讓電極內液和細胞膜內成分之間相互平衡，再施加去極化脈沖測試電流大?。涗涬娏餍盘柦汦PC-10膜片鉗放大器以3 kHz和10 kHz雙重濾波過濾．系統(tǒng)串聯(lián)電阻一般補償（Rseriescompensation）在60%～80%之間．實驗過程中系統(tǒng)電阻（Rs）始終保持在5～10 MΩ的范圍之內．線性漏電流和電容電流用P/4程序予以刪除，數據和圖形用pulsefit+pulse 8．0軟件采集分析并儲存在PC機微機硬盤上．PC機內置EPC-10的ITC-16多功能數據采集卡控制接口和數據的采集記錄．

1．6 加藥

實驗過程中均采用微量注射器（IM-5B，Narishige）進行加藥．加藥管為軟質玻璃毛細管經一步拉制而成，尖端口徑為30～50 μm．當加藥管灌滿液體后，施加少許正壓，防止當加藥管入水時，細胞外液因為管內負壓被倒吸而稀釋藥物濃度．加藥時，加藥管尖端置于距離實驗細胞80～100 μm左右，且在顯微鏡的一個視野平面內細胞和加藥管均應清晰可見．每次加藥的劑量為10 μL，加藥管內液體在10 s之內加完．之后立即給予細胞電刺激誘導，觀察藥物對電流的影響．

2 結果與討論

大鼠背根神經節(jié)（DRG）是一種單級感覺神經元細胞，其細胞膜上含有的離子通道類型非常豐富，有電壓門控鈉通道、電壓門控鉀通道和電壓門控鈣通道［10］．為了研究雷氏大疣蛛粗毒的生物學活性，作者采用全細胞膜片鉗記錄模式檢測了粗毒對大鼠背根神經節(jié)（DRG）細胞上電壓門控鈉、鉀、鈣通道的影響．

2．1 雷氏大疣蛛粗毒對電壓門控鈉通道的影響

DRG細胞上的電壓門控鈉通道有2種不同的類型:河豚毒素敏感型（TTX-S）和河豚毒素不敏感型（TTX-R）．一般來說，直徑大于40 μm的細胞幾乎只含有TTX-S型鈉通道，而直徑小于15 μm的細胞則同時含有2種類型的鈉通道．在記錄河豚毒素不敏感型鈉電流時，可在細胞外液中加入200 nmol/L河豚毒素，通過阻斷河豚毒素敏感型鈉通道而分離出河豚毒素不敏感型鈉通道．

2種類型的鈉電流均以同一種去極化單脈沖方式誘導激活:將細胞膜電位鉗制在－80 mV，測試電壓－10 mV，持續(xù)時間50 ms，每隔5 s重復一次．在全細胞記錄模式下，電流峰值幅度穩(wěn)定后，用微量注射器施加毒素，同時給予重復刺激，并觀察毒素對內向電流的影響．結果如圖1A、B所示，100 mg/L粗毒對TTX-R型鈉電流沒有明顯影響，但對TTX-S型鈉電流具有明顯抑制作用，說明粗毒中含有TTX-S型鈉通道阻斷活性的成分．100 mg/L粗毒抑制TTX-S型鈉電流圖形的形狀和對照電流基本保持一致，說明粗毒不影響TTX-S型鈉電流的激活相和失活相．

圖1 雷氏大疣蛛粗毒（100 mg/L）對大鼠DRG細胞上TTX-R型（A）和TTX-S型（B）鈉電流的影響（n=4）

作者進一步發(fā)現(xiàn)雷氏大疣蛛粗毒對TTX-S型鈉電流的抑制效應具有濃度依從性，其半數有效抑制濃度（IC50）為11．041 mg/L（圖2）．圖2中每個點的數據來自于4～6個實驗細胞，用平均值±標準誤差（mean±S．E．）來表示．濃度曲線用Boltzmman方程進行擬合得出IC50．方程Inhibition%=100/［1+exp（C－IC50）/k］中，C代表毒素濃度，IC50代表毒素半數有效抑制濃度，k是斜率．100 mg/L粗毒能抑制峰值電流幅度62．23%，但在6 min后可見較為明顯的恢復現(xiàn)象，這可能與毒素濃度因擴散而降低有關，同時也預示著雷氏大疣蛛粗毒與鈉通道的結合能力較弱．本研究室在研究3種蜘蛛粗毒對NG108-15細胞電壓門控鈉通道抑制作用時也發(fā)現(xiàn)，與雷氏大疣蛛粗毒相比，海南捕鳥蛛粗毒和虎紋捕鳥蛛粗毒中可能含有與TTX-S型鈉通道結合能力更強的配體［3］，也印證了雷氏大疣蛛粗毒與鈉通道結合能力較弱．

在全細胞膜片鉗記錄模式下，將細胞鉗制在－80 mV，分別給予一組測試電壓，其變化范圍為－80～+60 mV，步幅為+10 mV，持續(xù)時間為50 ms，可在DRG細胞上得到TTX-S型鈉通道的激活電流-電壓（I-V）關系曲線圖（圖3），并能揭示出通道的激活閾值（起始激活電壓）、最大激活峰值電流電壓和逆轉電位大?。诳瞻讓φ諚l件下，TTX-S型鈉通道的起始激活電壓為－60 mV，最大峰值電流激活電壓為－30 mV左右，逆轉電位為+25 mV左右．在細胞周圍加入100 mg/L雷氏大疣蛛粗毒后，讓毒素與細胞作用1～2 min，再以相同的去極化脈沖誘導I-V曲線，結果見圖3．粗毒幾乎在各個測試電位水平均能抑制TTX-S型鈉電流，但不改變內向電流最大峰值電流的激活電壓，對激活閾值和逆轉電位均有近－10 mV的漂移作用．激活閾值漂移說明雷氏大疣蛛粗毒使TTX-S型鈉通道更易激活，逆轉電位發(fā)生近－10 mV的漂移作用可推斷，粗毒中可能含有影響通道對鈉離子選擇透過性的配體．

圖2 雷氏大疣蛛粗毒抑制大鼠DRG細胞TTX-S型鈉電流的濃度效應曲線

圖3 雷氏大疣蛛粗毒（100 mg/L）對大鼠DRG細胞TTX-S型鈉通道電流-電壓關系（I-V curve）的影響

采用一標準雙脈沖刺激方式，進一步觀察了雷氏大疣蛛粗毒對TTX-S型鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活特征的影響（圖4）．雙脈沖刺激參數為:先將細胞膜電壓預鉗制在－130 mV，持續(xù)時間為1 s，再將膜電位變?yōu)椋?0 mV，持續(xù)時間為0．5 ms，以消除細胞膜電容的充電狀態(tài)，再將去極化電壓躍遷至－10 mV，去極化持續(xù)時間為50 ms，之后，膜電位回到－80 mV．進行下一次刺激時，只需改變預鉗制電壓（－130 mV～－20 mV，步幅為+10 mV，持續(xù)時間1 s），測試電壓水平同上所述．在不同預鉗制電壓條件下，發(fā)現(xiàn)一般細胞預鉗制在－130 mV時誘導出的峰值電流幅度最大，隨著預鉗制電壓的增大，峰值電流幅度逐漸減小，當預鉗制在－30 mV時起，相同測試電壓幾乎不能誘導出電流．圖4中每個點的數據均來自5個實驗細胞，用平均值±標準誤差（mean±S．E．）來表示．兩條光滑曲線經Boltzmann方程擬合獲得:I/Imax=1/［1+exp（VV1/2）/k］，其中V1/2是半數穩(wěn)態(tài)失活電壓，k是斜率，V是指預鉗制電壓．圖4展示了在空白對照條件下，TTX-S型鈉通道的半數穩(wěn)態(tài)失活電壓（V1/2）為－61．68 mV（n=5），在加入100 mg/L粗毒后，V1/2變?yōu)椋?8.44 mV （n=5）．結果表明，雷氏大疣蛛粗毒能影響TTX-S型鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活特征，并使曲線向超極化方向漂移15 mV左右，雷氏大疣蛛粗毒使TTX-S型鈉通道更容易失活．

圖4 雷氏大疣蛛粗毒（100 mg/L）對大鼠DRG細胞TTXS型鈉通道穩(wěn)態(tài)失活動力學特征的影響（n=5）

2．2 雷氏大疣蛛粗毒對電壓門控鉀通道的影響

在DRG細胞上全細胞記錄模式下，將細胞膜電位鉗制在－80 mV并去極化至+30 mV，持續(xù)時間為300 ms時，可觀察到一明顯的外向延遲整流鉀電流，待峰值電流穩(wěn)定，加入100 mg/L粗毒后，再以相同去極化脈沖刺激，電流峰值幅度幾乎不降低（圖5 A）;同樣的刺激方式也可以觀察到瞬時激活鉀電流，100 mg/L粗毒對電流峰值也沒有明顯改變（圖5 B），表明雷氏大疣蛛粗毒中可能不含有阻斷電壓門控鉀通道的活性成分．

圖5 雷氏大疣蛛粗毒對大鼠DRG細胞鉀電流的影響（A為延遲整流鉀電流，B為瞬時激活鉀電流）

2．3 雷氏大疣蛛粗毒對電壓門控鈣通道的影響

在DRG細胞膜上主要分布著兩種類型的電壓門控鈣通道:高閾值激活（high voltage-activated，HVA）鈣通道和低閾值激活（low voltage-activated，LVA）鈣通道．根據這兩類鈣通道不同的藥理學特征和結合配體，可將二者區(qū)分開來．在全細胞記錄模式下，將細胞膜電位鉗制在－90 mV并去極化至－40 mV時只能誘導LVA鈣通道激活產生電流;而將細胞膜電位鉗制在－40 mV并去極化至0 mV時只能誘導HVA鈣通道激活產生電流．此外，LVA鈣通道又稱T（transient）型鈣通道，其失活速度遠快于HVA鈣通道．HVA鈣通道包含N型和L型兩種類型．目前，已經在蜘蛛、芋螺等動物毒素中找到了多種多肽類鈣通道毒素，且針對HVA型和LVA型鈣通道具有不同選擇性，專一性強，如HWTX-I、ω-agatoxin IIIA等能阻斷N型鈣通道，但對T型或L型鈣通道均無作用．ProTx I-II能阻斷T型鈣通道．

圖6表明，在加入100 mg/L粗毒后，持續(xù)時間150 ms，HVA型（圖6A）和LVA型（圖6B）鈣電流峰值電流幅度均無明顯變化，說明雷氏大疣蛛粗毒對鈣通道不敏感，粗毒可能不含阻斷鈣通道的活性物質．

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Effects of Venoms from the Spider Macrothele Raveni on Voltage-Gated Na+，K+and Ca2+Channels in Rat Dorsal Root Ganglia Neurons

WANG Xiao-juan，ZHU Yang-hui，LIU Zhong-hua*
（Key Laboratory of Protein Chemistry and Developmental Biology，Ministry of Education，
College of Life Science of Hunan Normal University，Changsha 410081，China）

By whole-cell patch-clamp recording，it was observed the effects of the vemon from the spider Macrothele raveni on voltage-activated Na+，K+and Ca2+channels in adult rat dorsal root ganglia（DRG）neurons．It has no evident effect on tetrodotoxin-resistant（TTX-R）Na+currents，K+currents and Ca2+currents，while it is able to inhibit tetrodotoxin-sensitive（TTX-S）Na+currents．The inhibition is dose-dependent with an IC50value of 11．04 mg/L．At a concentration of 100 mg/L it can cause both the initial activated voltage and the membrane reversal potential to shift 10 mV in the hyperpolarizing direction．And it also causes the steady-state inactivation curve of TTX-S Na+channels to shift approximate 15 mV in the hyperpolarizing direction without changing the slope factor （k）significantly．

Macrothele raveni;crude vemon;dorsal root ganglian（DRG）;whole-cell patch-clamp;tetrodotoxin-sensitive sodium channel

Q424

A

1000-2537（2011）05-0080-06

2011-03-21

國家自然科學基金資助項目（31070699;30700127）

*通訊作者，E-mail:liuzh@hunnu．edu．cn

（編輯王?。?/p>