祛斑膏的制備與質(zhì)量控制

關(guān)世俠，曹麗萍，李海剛，李中桂，許淑芹，李杜軍，周郁斌，袁中文

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，510006)

皮膚色素沉著是一種常見的多發(fā)性皮膚疾病，主要由人體內(nèi)分泌失調(diào)引起。皮膚色素沉著表現(xiàn)為黃褐斑、雀斑等。中藥制劑以其不良反應(yīng)小、不易產(chǎn)生耐藥性的特點在治療色素沉著方面具有較大優(yōu)勢。筆者針對皮膚色素沉著的病因及病理特點，根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論組方，按照中藥制劑原理制備的祛斑膏有活血、解郁、潤膚、增白的功效，用于黃褐色斑及色素沉著斑的治療。該方中丹參為君藥，其主要作用為活血、祛瘀鎮(zhèn)痛、消癰、養(yǎng)血等作用［1］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示:酪氨酸酶是黑色素產(chǎn)生過程中重要的催化劑，方中的丹參、白芷具有抗酪氨酸酶活性，可抑制黑色素的產(chǎn)生［2］。為有效控制其質(zhì)量，筆者在本實驗采用薄層色譜(TLC)法對方中丹參、白芷、進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜(HPLC)法對丹參酮ⅡA進(jìn)行了含量測定。

1 材料

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀(LC-solution工作站)，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，JJ200型精密電子天平(美國雙杰兄弟有限公司常熟雙杰測試儀器廠)，硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)。

1.2 試藥 丹參酮ⅡA對照品(批號:110766-200416)，白芷對照藥材(批號:120945-200506)，丹參對照藥材(批號:927-200110)，均由中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純，祛斑膏(批號:100308，100509，100617)及陰性樣品均為本院自制。

2 處方與制備

2.1 處方 丹參、白芷、茯苓各120 g，白芨、蒺藜各110 g，白鮮皮 105 g，僵蠶、川芎各 85 g，白芍 80 g，白蘞、香附各70 g，蜂蜜430 g，尼泊金2.5 g，甘油120 mL，純化水。

2.2 制法 取處方比例藥材粉碎，過篩孔內(nèi)徑(150.0±6.6)μm(六號)篩，混勻，取細(xì)粉 545 g，備用。另取蜂蜜430 g，加純化水至560 mL，煮沸，加入尼泊金2.5 g，溶解，加甘油120mL，混勻，過濾，與上述細(xì)粉混勻，流通蒸汽滅菌1 h，取出放冷至室溫，制成祛斑膏1 000 g，分裝成每盒10 g，即得。

3 質(zhì)量控制

3.1 薄層鑒別

3.1.1 白芷 取祛斑膏10 g，加乙醚100 mL，浸泡1 h，濾過時振搖，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯10 mL使溶解，作為供試品溶液;按處方配比，取除白芷外的其他藥味，同法制成陰性樣品溶液;另取白芷對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液;再取歐前胡素對照品，加乙酸乙酯制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述4種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)-乙醚(3∶2)為展開劑，在25℃以下展開，取出，晾干，置紫外燈(波長365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的熒光，陰性樣品無干擾，見圖1。

3.1.2 丹參 取祛斑膏10 g，加石油醚30 mL，振搖，放置1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液;另取丹參對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液;另取丹參酮ⅡA對照品，加乙酸乙酯制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液;再按處方配比，取除丹參外的其他藥味，同法制成陰性溶液。照薄層色譜法［3］實驗，吸取上述4種溶液各10μL，分別點于同一含羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紅色斑點，陰性樣品無干擾，見圖1。

圖1 白芷和丹參TLC色譜圖1.對照品;2.對照藥材;3，4，5.供試品;6.陰性對照品

3.2 含量測定

3.2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相:甲醇-水(75∶25)，流速1 mL·min-1，檢測波長:270 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為10 μL。

3.2.2 溶液的制備

3.2.2.1 對照品溶液 精密稱取105℃干燥至恒重的丹參酮ⅡA對照品適量，用甲醇制成每毫升含10.5μg的溶液，即得。

3.2.2.2 供試品溶液 取本品內(nèi)容物約1 g，精密稱定，置50 mL量瓶，加甲醇至刻度，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液，用孔徑0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2.2.3 陰性對照溶液 取除丹參外的處方量藥材，按制備工藝制備缺丹參的陰性樣品，再按“3.2.2.2”項下方法，制成缺丹參的陰性溶液。

3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取“3.2.2.1”下的對照品溶液，精密吸取 2，4，6，8，10 μL 進(jìn)樣，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得丹參酮ⅡA回歸方程Y=53 026X-3 587.1(r=0.999 9，n=5)。結(jié)果表明丹參酮ⅡA在0.021～0.105μg范圍內(nèi)線性良好。

3.2.4 專屬性實驗 分別吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，按照“3.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明，陰性樣品無干擾，見圖2。

3.2.5 精密度實驗 取“3.2.2.1”項下的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定丹參酮ⅡA峰面積RSD為0.58%，符合要求。

圖2 陰性對照品、對照品、供試品的HPLC色譜圖A.陰性對照品;B.對照品;C.供試品;1.丹參酮ⅡA

3.2.6 重復(fù)性實驗 取同一批號樣品0.5 g，精密稱定，共6份，分別按“3.2.2.2”項供試品溶液制備操作，按“3.2.1”項下色譜條件分析測定。結(jié)果樣品中丹參酮ⅡA平均含量為255μg·g-1，RSD為0.35%。

3.2.7 穩(wěn)定性實驗 取同一批號樣品0.5 g，精密稱定，按照“3.2.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“3.2.1”項下色譜條件分析，分別在 0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，測得峰面積的RSD為1.02%。結(jié)果表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.8 加樣回收率 精密稱取已知含量的同一批祛斑膏0.5 g，分別加入一定量濃度為0.25 mg·mL-1的丹參酮ⅡA對照品，按供試品溶液制備項下操作，平行操作9份，按上述色譜條件測定含量，計算回收率，結(jié)果平均回收率99.63%，RSD=0.37%(n=6)。見表1。

表1 丹參酮ⅡA加樣回收實驗結(jié)果 μg，n=9

3.2.9 樣品含量測定 取3個批號的祛斑膏樣品，按照“3.2.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“3.2.1”項下色譜條件分析測定，計算含量。結(jié)果批號為100308，100509，100617樣品中丹參酮ⅡA含量分別為255，257，259 μg· g-1，平均 257 μg· g-1，RSD=0.65%。

4 討論

丹參為該制劑的君藥，丹參的化學(xué)成分分脂溶性和水溶性。脂溶性成分有丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮、二氫丹參酮等;水溶性成分有原兒茶醛及丹參素等。其中丹參酮ⅡA為其主要活性成分之一，所以本制劑通過HPLC對其主要的活性成分丹參酮ⅡA進(jìn)行含量測定，為保證制劑的質(zhì)量提供了依據(jù)。實驗過程中比較甲醇回流提取法和超聲提取法，2種方法提取的丹參酮ⅡA含量非常接近，超聲提取法操作簡單，故采用超聲提取法提取。

［1］ 翟學(xué)佳，徐錦鳳.高效液相色譜法同時測定丹參藥材水溶性和脂溶性成分的含量［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，28(10):1345-1348.

［2］ 趙永耀.中醫(yī)美容學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:175.

［3］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:70，97.