3-氨基苯甲酰胺聯(lián)合順鉑抑制骨肉瘤細(xì)胞生長的作用

鄭亞東，徐西強(qiáng)，彭飛，虞冀哲，吳華

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，武漢 430030)

骨肉瘤是兒童及青少年最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，其惡性程度、致殘率、致死率高。20世紀(jì)70年代以前，對骨肉瘤患者進(jìn)行包括截肢在內(nèi)的局部治療，總體生存率10% ～20%。隨著化學(xué)治療(化療)水平逐漸提高，骨肉瘤患者的長期生存率得到明顯改善，對于原發(fā)無轉(zhuǎn)移的患者，約70%患者可以獲得長期生存［1］。順鉑是骨肉瘤化療方案中的一線藥物，在臨床上廣泛使用。但是近來化療耐藥及對化療不敏感的患者越來越多，骨肉瘤的療效也停滯不前。聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1［poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1］是一類存在于所有哺乳動物細(xì)胞及大部分真核細(xì)胞中催化聚ADP核糖化的細(xì)胞核酶，其參與的聚ADP核糖化是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾方式，PARP-1在DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［2］。3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide，3-AB)是一種有效的PARP-1抑制藥，筆者在本研究擬探討3-AB聯(lián)合順鉑對人類骨肉瘤細(xì)胞U2OS生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 骨肉瘤細(xì)胞U2OS購于武漢博士德生物工程有限公司，3-AB為Enzo生物化學(xué)公司產(chǎn)品，Cell count kit-8為碧云天公司產(chǎn)品，碘化丙啶(propidium iodide，PI)，RNase 購于 Sigma 公司，McCoy＇s 5 α Medium Modified培養(yǎng)基購于Sigma公司，胎牛血清購于Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞U2OS細(xì)胞用含10%胎牛血清的McCoy＇s 5αMedium Modified培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 d換液1次，待細(xì)胞鋪滿瓶底 ＞80%時(shí)，0.25%胰酶消化，按1∶3的比例傳代。

1.2.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 將U2OS細(xì)胞按每孔3 000個的密度種于96孔板，接種兩塊板，為單純順鉑處理板和順鉑聯(lián)合3-AB處理板，單純順鉑處理板分為7組，分別為①組:空白組，不加細(xì)胞，②組:陰性對照組，細(xì)胞加完全培養(yǎng)基，③～⑦組:細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μg·mL-1順鉑溶液。順鉑聯(lián)合3-AB處理板同樣分為7組，①②組同前，而分別在上述③～⑦組中再加入15 mmol·L-13-AB，以上所有組均設(shè)5個復(fù)孔，刺激48 h，然后按照CCK-8說明書操作，酶標(biāo)儀450 nm波長測定吸光度(A值)。設(shè)陰性對照組細(xì)胞存活率為100%，按照如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率:存活率(%)=(加藥組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期 將U2OS細(xì)胞按每皿5×104個密度種于直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，接種12個皿，分為4組，①組為陰性對照組，予以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，②組為3-AB處理組，培養(yǎng)基中加入10 mmol·L-13-AB，③組為順鉑處理組，培養(yǎng)基中加入3μg·mL-1順鉑溶液，處理6 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，④組為3-AB聯(lián)合順鉑處理組，培養(yǎng)基中加入3μg·mL-1順鉑溶液，處理6 h后換含10 mmol·L-13-AB的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每組3皿，分別培養(yǎng)24，48，72 h后，收集細(xì)胞，預(yù)冷的80%乙醇固定-20℃過夜，加入PI染液及RNase，室溫避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析比較差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 單純順鉑處理及與3-AB陰性聯(lián)合處理后細(xì)胞的存活率見圖1，兩組細(xì)胞的存活率均隨順鉑濃度的增高而逐漸降低。不同濃度及時(shí)間3-AB對U2OS細(xì)胞的增殖活性的影響之前我們已做過研究，并篩選出刺激后細(xì)胞的存活率至少90%的最大耐受濃度及時(shí)間，即上述的15 mmol·L-13-AB刺激48 h作為與順鉑聯(lián)合的濃度及時(shí)間，按照文獻(xiàn)［3］方法，采用SPSS軟件比較順鉑處理組及聯(lián)合刺激組增殖抑制率達(dá)50%時(shí)的順鉑濃度，即半數(shù)抑制濃度(IC50)，單純順鉑處理 IC50為1.150 03 μg·mL-1，聯(lián)合刺激組的IC50為0.652 54μg·mL-1，增敏比為1.76。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測 與陰性對照組比較，經(jīng)單純3-AB處理，及3-AB與順鉑聯(lián)合處理后細(xì)胞的凋亡率均增加，而3-AB聯(lián)合順鉑處理后細(xì)胞的凋亡率較單純3-AB、順鉑處理的凋亡率為高，見圖2，提示3-AB加強(qiáng)順鉑對U2OS細(xì)胞的促凋亡作用。

3 討論

順鉑作為常用的化療藥物廣泛應(yīng)用于臨床，但是存在腎毒性、嚴(yán)重的嘔吐發(fā)應(yīng)和神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)，以及內(nèi)在性和獲得性耐藥限制其應(yīng)用［4］。近年許多研究者應(yīng)用其他藥物與順鉑聯(lián)合來加強(qiáng)順鉑的療效，減少其副作用和耐藥性。PARP-1抑制藥則是其中研究較多的一種。

1963年法國斯特拉斯堡Mandel小組發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞核中尼克酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)促進(jìn)已標(biāo)記的ATP合成一種難溶于酸的片段［5］，后被研究者證實(shí)為聚腺苷酸二磷酸核糖，并從肝細(xì)胞核中提取一種新的酶，即PARP。PARP參與DNA修復(fù)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，被認(rèn)為在細(xì)胞生存及死亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用，并參與腫瘤發(fā)生及炎癥反應(yīng)過程中轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)［6］。

多項(xiàng)體外及體內(nèi)研究證實(shí)抑制PARP-1的功能可以加強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性，如MIKNYOCZKI等［7］研究發(fā)現(xiàn) PARP-1抑制藥 CEP-6800在體外加強(qiáng)順鉑對Calu非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞的作用，并增強(qiáng)順鉑對荷瘤裸鼠的治療效果;DONAWHO等［8］研究表明PARP抑制藥ABT-888增強(qiáng)順鉑對乳腺癌裸鼠移植瘤模型的治療效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PARP-1抑制藥3-AB與順鉑聯(lián)合較單獨(dú)應(yīng)用順鉑對骨肉瘤細(xì)胞U2OS抑制作用增加，增敏比為1.76，證實(shí)3-AB可以加強(qiáng)U2OS細(xì)胞對順鉑的敏感性;運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測了聯(lián)合組和單純順鉑組的細(xì)胞凋亡率，證實(shí)聯(lián)合組U2OS細(xì)胞的凋亡率高于單純順鉑組，而細(xì)胞周期分析的結(jié)果顯示3-AB與順鉑聯(lián)合組較單純順鉑組細(xì)胞周期阻滯于S期的時(shí)間更長，研究表明［9-10］，當(dāng)細(xì)胞遭受DNA損傷時(shí)，細(xì)胞通過一系列調(diào)節(jié)機(jī)制抑制細(xì)胞周期進(jìn)行，抑制DNA復(fù)制，阻止細(xì)胞的分裂，為DNA修復(fù)系統(tǒng)提供時(shí)間進(jìn)行DNA修復(fù)，若修復(fù)成功，細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行或完成下一個細(xì)胞周期事件，若修復(fù)不完全或不能修復(fù)，細(xì)胞則發(fā)生凋亡。筆者推測，順鉑引起骨肉瘤細(xì)胞DNA損傷，細(xì)胞周期停滯，而同時(shí)應(yīng)用3-AB則抑制了DNA修復(fù)過程，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于S期的時(shí)間更長，而DNA修復(fù)受到抑制，導(dǎo)致凋亡增加。

綜上所述，PARP-1抑制藥3-AB能增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性，增強(qiáng)順鉑對骨肉瘤細(xì)胞的促凋亡作用，本研究結(jié)果為進(jìn)一步應(yīng)用PARP-1抑制藥為化療增敏劑提供了初步依據(jù)。

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