Dicer在腫瘤中的研究進展

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院(110001) 王雪梅 王 敏

作者:王雪梅，中國醫(yī)科大學研究生在讀，現(xiàn)工作單位沈陽市婦嬰醫(yī)院。

Dicer是一個相對分子質(zhì)量約200000的多結構域蛋白質(zhì)，是miRNA的形成過程中需要作為RNaseⅢ家族成員的一種關鍵酶。在產(chǎn)生miRNA的生物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。通過與靶mRNA特異的堿基配對，引起靶mRNA降解或者翻譯抑制，產(chǎn)生轉錄后基因沉默。Dicer與腫瘤的關系已在多種腫瘤中得到證實，現(xiàn)就Dicer與腫瘤的研究進展做一綜述。

1 Dicer的結構

Dicer是一個相對分子質(zhì)量約200000的多結構域蛋白質(zhì)，通常含有6個結構域，它們是:1個RNA解旋酶-DEXH盒子、1個含結合 dsRNA折疊的DUF283、1個結合dsRNA末端的折疊的DUF283、1個結合dsRNA末端的PAZ、2個RIII和1個dsRNA結合結構域。PAZ結構域同時存在于構成RNA沉默復合物的Argonaute(Ago)蛋白質(zhì)家族中.事實上，PAZ就取名于3個主要的Ago蛋白質(zhì)，即Piwi、Ago和Zwille。賈第蟲Dicer僅有1個PAZ、2個RIII結構域[1]，比哺乳動物Dicer要小得多，但在體外卻有正常的裁剪活性。對賈第蟲Dicer晶體結構的研究揭示了Dicer制造確定長度小RNA的機制:Dicer的晶體結構外形象短柄斧，2個RIII結構域構成刃部，PAZ結構域構成柄端，之間通過長α螺旋相連，相距約65?，相當于25ntRNA 的長度[2]。

哺乳動物中只存在一種 Dicer[1]，它同時負責miRNA和 siRNA的產(chǎn)生。其中，miRNA的產(chǎn)生過程首先是pri-miRNA在細胞核內(nèi)被Drosha-DGCR8復合體切割成60～70nt的pre-miRNA，然后再被細胞質(zhì)中的Dicer-TRBP復合體切割成為20～22nt的成熟miRNAs，進而調(diào)節(jié)基因表達。有報道顯示，miRNA可以調(diào)節(jié)大約30%的內(nèi)源基因的表達[1，3-4]。其中有許多涉及到生物體的生命活動的調(diào)節(jié)，如生物體的生長發(fā)育，細胞的死亡和分化等[5]。在生長發(fā)育方面，Dicer通過產(chǎn)生miRNA來調(diào)節(jié)與血管形成有關基因如let-7family、mir-27b的表達來調(diào)控生物體血管的形成，而且在缺乏Dicer的胚胎干細胞在發(fā)育早期便發(fā)生了死亡的現(xiàn)象，也就進一步證明Dicer在保證生物體的正常生長發(fā)育中不可或缺[6-8]。在調(diào)節(jié)細胞方面，Dicer可以影響細胞的分化，Barbato等[9]發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元有絲分裂后期分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的過程中，Dicer表現(xiàn)出優(yōu)先分配到與細胞分化有關的高爾基體網(wǎng)狀結構區(qū)域，并在成熟和生長階段不斷地調(diào)整分布。Dicer除了影響細胞分化以外還在調(diào)節(jié)細胞數(shù)量方面起著很重要的作用，這可能是通過調(diào)節(jié)細胞異染色質(zhì)和著絲粒的形成來完成的，如小雌鼠缺失Dicer的卵母細胞在減數(shù)分裂過程中的停滯、無序的紡錘體的出現(xiàn)、染色體配對的缺失，以及在人類無Dicer細胞中，異染色質(zhì)形成的異常都是很好的證明，加上Chiosea等發(fā)現(xiàn)的Dicer在高癌變區(qū)域與正常表達水平相比表現(xiàn)出的下調(diào)和一小部分癌細胞出現(xiàn)了刪除Dicer位點而使Dicer缺失的現(xiàn)象，從另外一個方面證明，Dicer具有控制細胞數(shù)量和細胞凋亡的功能[10-12]

2 Dicer與miRNAs

MiRNAs是一類新的、非編碼的、內(nèi)源性小RNAs，長約20～25個核苷酸?？梢酝ㄟ^抑制蛋白質(zhì)翻譯、剪切mRNA調(diào)節(jié)靶基因的表達。它們被命名為微小RNA(miRNA)。這是一類具有調(diào)節(jié)其他基因表達活性的小RNA。在生物的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。miRNA是內(nèi)源性的，從編碼miRNA的基因轉錄長鏈初始miRNA(primiRNA)，分別在核內(nèi)和胞漿經(jīng)兩步加工形成。miRNAs通過直接剪切靶mRNAs，或者通過完全/不完全與靶mRNAs 3非翻譯區(qū)互補結合抑制靶mRNAs的翻譯。這些靶mRNAs進一步調(diào)控多種生物學行為，如發(fā)育的進程、干細胞分化 、細胞凋亡、疾病以及腫瘤發(fā)生[13-16]。Garcia I研究顯示，30% 以上的蛋白編碼基因可能成為miRNAs的靶基因，50% 的miRNA位于腫瘤相關基因組的區(qū)域或者脆弱的位點[17]，提示miRNA可能在部分腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。

miRNA的產(chǎn)生過程首先是pri-miRNA在細胞核內(nèi)被Drosha-DGCR8復合體切割成60～70 nt的pre-miRNA，然后再被細胞質(zhì)中的Dicer-TRBP復合體切割成為20～22 nt的成熟miRNAs，進而調(diào)節(jié)基因表達。首先是初期miRNA復合體(pri-miRNA)被加工成的70個核苷酸的miRNA前體(pre-miRNA)，然后miRNA前體在Dicer酶、ATP和解旋酶的共同作用下分裂成21～25 bp的成熟miRNA。miRNA成熟過程中的連續(xù)分裂，需要2個RNaseⅢ:Drosha和 Dicer催化[18]，兩者都是特定 dsRNA 的RNA內(nèi)切酶。Drosha主要存在于細胞核內(nèi)，有1個dsRNA識別結構域、2個RNaseⅢ結構模體和1個未知功能的末端。

miRNA的形成過程中需要作為RNaseⅢ家族成員的兩種酶Drosha和Dicer催化。Drosha主要存在于細胞核內(nèi)，具有1個雙鏈RNA結合域(dsRNA2binding domain，dsRBD)、2個RNaseⅢ結構域和1個功能未知的氨基酸末端延伸區(qū)域。不管pri2miRNA序列及結構如何，Drosha都會將其分裂成70nt的pre2miRNA，但其切割pre2miRNA的機理尚不清楚.Dicer酶包含1個RNA解旋酶結構域、1個 DUF283 結 構 域、1 個 PAZ(Piwi2Argonaute2Zwille)結構域、2個RNaseⅢ域和1個dsRBD。Dicer比RNaseⅢ家族其他成員多1個PAZ結構域，該結構域對酶的功能起著重要作用[19]。

miRNA能夠通過與靶mRNA特異性的堿基配對引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而對基因進行轉錄后表達調(diào)控。當miRNA與某一基因同源時，若與該基因mRNA的3，端非翻譯區(qū)不完全互補結合，此時RISC會阻止該基因mRNA翻譯成相應的蛋白質(zhì)，稱之為翻譯抑制[20]。若與該基因mRNA完全互補結合，則在RISC核酸內(nèi)切酶Dicer的作用之下，該基因 mRNA就會被切割降解，達到基因沉默效應，發(fā)揮類似 siRNA的作用[21]。miRNA途徑可能是使干細胞對外界信號不敏感而導致細胞周期停止在G/S過渡期的其中一個機制。Lee[22]等利用siRNA技術剔除Hela細胞中miRNA生成關鍵酶Dicer的表達，發(fā)現(xiàn)癌基因HMGA2(highmobility group A2)表達明顯升高，顯示HMGA2表達可能通過miRNA調(diào)控，并證實HMGA2在腫瘤發(fā)生中的高表達可以通過以下2個途徑:1)染色體移位截斷HMGA2 3 UTR，導致Let-7的靶標缺失。2)Let-7表達降低。然而，Kanellopoulou[23]等最近證實，缺少Dicer的鼠胚胎干細胞盡管有異染色質(zhì)不足的現(xiàn)象發(fā)生，但并不引起染色體的數(shù)目或者結構失常，并且注射這些缺少Dicer的胚胎干細胞到裸鼠中也不會導致腫瘤發(fā)生。因此，Dicer在腫瘤發(fā)生中的作用可能是非直接的，可能是通過其缺失而導致了具有腫瘤抑制因子效應的miRNAs的減少起作用的。小鼠Dicer基因的缺失研究表明，這個基因在哺乳動物發(fā)育和干細胞正常分化、T細胞發(fā)育、四肢形成的重要性。

3 Dicer與腫瘤

在miRNA途徑中，Dicer的作用至關重要。miRNA序列、結構、豐度和表達方式的多樣性，使其可能作為mRNA編碼蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)因子，對基因表達、細胞周期調(diào)控乃至個體發(fā)育產(chǎn)生重要影響。最近研究表明，Dicer的表達量的改變與腫瘤的發(fā)生有關[24-25]。有文獻報道，在對皮膚腫瘤的研究中，miRNA生成過程中的重要酶Dicer和Drosha的失調(diào)相對于正常組織是顯著的，因而提出miRNA參與了皮膚上皮性腫瘤發(fā)生的假說。2005年首次證明人類肺癌中Dicer的表達下調(diào)，并指出其表達水平與臨床病理特征及預后有密切關系。Karube[26]等發(fā)現(xiàn)，Dicer的表達量下降與術后存活期縮短相關。從而表明了Dicer可能阻止肺組織的轉化。由于Dicer與異染色質(zhì)的維持和中心粒沉默有關，其蛋白質(zhì)水平的降低可能直接導致基因組的不穩(wěn)定，從而引起腫瘤形成。此外，在前列腺癌、胃癌、原發(fā)性肝癌、乳腺癌以及頭頸部涎腺癌中均有Dicer表達情況的相關研究，但Dicer在各種腫瘤中的表達并不完全一致。Simion Chiosea[27]等人在前列腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，Dicer蛋白在前列腺癌組織中表達水平明顯高于良性前列腺增生組織和正常的前列腺組織，而且與腫瘤的分型、分期和腫瘤侵襲性本身密切相關，高表達Dicer的前列腺癌更容易擴散、復發(fā)，患者病死率也高，即在前列腺癌中Dicer高表達與腫瘤的轉移呈正相關。Zheng Zhihong等[28]報道，在胃癌的發(fā)展中Dicer的表達是逐漸下降的，特別是進展期胃癌中，并推測這與miRNA的啟動子區(qū)甲基化有關，這也證明了Dicer在腫瘤發(fā)展中起重要作用。在原發(fā)性肝癌的研究中，發(fā)現(xiàn)Dicer mRNA在原發(fā)性肝癌中的表達量明顯下降，Dicer蛋白在原發(fā)性肝癌中亦定位于胞漿中，是在胞漿中發(fā)揮功能的一種酶。并且可以初步判定Dicer蛋白在肝癌中的表達量是增加的。Chen C[29]等人證實，Dicer基因翻譯水平蛋白的變化與轉錄水平mRNA的變化正好相反，說明在原發(fā)性肝癌中Dicer基因在轉錄水平到翻譯水平存在某種調(diào)節(jié)放大機制或存在其他調(diào)節(jié)途徑，使其蛋白水平放大。在體外細胞的RNAi試驗說明，Dicer蛋白在低分化細胞系中的高表達與該細胞的惡性增殖趨勢有關，而與HBV在該細胞中的持續(xù)復制無關。G Grelier[30]等在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌細胞系McF-7中除去Dicer可以阻滯G1期，還可以增加對DNA損傷劑順鉑的敏感性。所以可以應用抗-Dicer方法與傳統(tǒng)的化療去治療乳腺癌。SI Chiosea等[31]在78例上消化道黏液表皮樣癌中研究Dicer蛋白的表達情況，結論為Dicer可以作為低生存率的單變量指標，其異常表達與腫瘤的分化高級別及腫瘤處于晚期有關。Dicer亦是頭頸部黏液表皮樣癌的獨立預后因素之一。

關于婦科腫瘤的研究。Chen等[32]研究發(fā)現(xiàn)，促進腫瘤演進和化療耐藥卵巢癌中Dicer的表達與腫瘤臨床病理特征呈負相關，預后不良的患者Dicer表達更低。休斯頓德克薩斯大學腫瘤中心William M.Merritt[33]檢測了111例患者侵襲性上皮卵巢癌標本中Dicer和Drosha酶的mRNA的水平，并且分析其與臨床預后的關系。結果表明，Dicer和Drosha酶的mRNA水平和它們相應的蛋白表達水平是對應的。Dicer的低表達率和腫瘤分期明顯相關，Drosha的低表達則與較低的外科(腫瘤細胞減滅術)治療率有關，分別為:低表達Dicer，較高(惡性)分期的病理特征，對化療的低敏感性。Dicer和Drosha基因檢查卻幾乎沒有發(fā)現(xiàn)錯配的變異，但是無論出現(xiàn)或不出現(xiàn)變異都與表達水平無關。Pampalakis[34]等研究Dicer在34例卵巢組織中的表達情況，實驗得出Dicer胭A在卵巢惡性腫瘤中的表達水平與正常及良性腫瘤的表達水平相比是顯著下調(diào)的。Nam EJ等[35]闡述，miRNA在復發(fā)性卵巢癌中失調(diào)的機制，Dicer蛋白在原發(fā)及復發(fā)的腫瘤之間的表達區(qū)別還有待研究。

綜上所述，目前Dicer在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及臨床應用價值還不甚清楚，有待更多更深入地研究予以明確。雖然分子生物學技術和信息生物學飛速發(fā)展簡便了研究，但由于腫瘤發(fā)生過程復雜以及作用方式的網(wǎng)絡化等均給研究帶來挑戰(zhàn)，因此探索之旅仍將是一條漫長的科學之路。

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