杜氏鹽藻類驅(qū)動蛋白鈣調(diào)素結(jié)合蛋白馬達(dá)區(qū)的表達(dá)與純化*

徐朋奇，李 杰，張紅梅，石 科，韓 康，李 梅，薛樂勛#

1)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州 450001 2)中國科學(xué)院生物物理研究所生物大分子國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100101

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻類驅(qū)動蛋白鈣調(diào)素結(jié)合蛋白馬達(dá)區(qū)的表達(dá)與純化*

徐朋奇1)，李 杰1)，張紅梅2)，石 科1)，韓 康1)，李 梅2)，薛樂勛1)#

1)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州 450001 2)中國科學(xué)院生物物理研究所生物大分子國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100101

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻;類驅(qū)動蛋白鈣調(diào)素結(jié)合蛋白;純化

目的:構(gòu)建杜氏鹽藻類驅(qū)動蛋白鈣調(diào)素結(jié)合蛋白馬達(dá)區(qū)(KMD)基因原核表達(dá)載體并表達(dá)純化KMD。方法:通過軟件和在線工具預(yù)測KMD的理化性質(zhì)。構(gòu)建KMD的原核表達(dá)載體pET28a-KMD，而后在大腸桿菌BL21(DE3)內(nèi)16℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)KMD，通過超聲破碎菌體和高速離心，將上清液進(jìn)行親和層析，獲得粗純目的蛋白，再利用離子交換層析和凝膠過濾層析進(jìn)一步純化。SDS-PAGE檢測層析各階段蛋白樣品。將純化后的KMD均分3份分別放置在－80℃、4℃和18℃環(huán)境中，1周后SDS-PAGE檢測目的蛋白是否降解。結(jié)果:KMD相對分子質(zhì)量為37 480，預(yù)測pI為7.99?；蛑泻械南∮忻艽a子不會明顯影響其在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。多步層析后可以獲得2個(gè)獨(dú)立的目的蛋白洗脫峰，均為KMD且純度可滿足結(jié)晶條件搜索。純化后的KMD在4℃和18℃下放置1周后無降解。結(jié)論:獲得大量高純度、均一性良好的KMD蛋白，能夠滿足培養(yǎng)蛋白晶體所需。

驅(qū)動蛋白(kinesin)是分子馬達(dá)的一種，它可以通過水解ATP將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，沿微管定向運(yùn)動，參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞器定位等重要生命活動。類驅(qū)動蛋白鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(kinesin-like calmodulin-binding protein，KCBP)是Kinesin-14家族成員，1996年由Reddy等［1］用生物素標(biāo)記的鈣調(diào)素(Calmodulin，CaM)篩選擬南芥表達(dá)文庫時(shí)首次發(fā)現(xiàn)，是首個(gè)通過與CaM直接作用來調(diào)節(jié)和微管結(jié)合的驅(qū)動蛋白［2］。2004年和2008年分別報(bào)道了土豆KCBP C端不同聚合狀態(tài)的兩種晶體結(jié)構(gòu)，并從結(jié)構(gòu)角度推測出其與CaM相互作用的模型。該模型指出CaM會在馬達(dá)區(qū)與微管之間形成空間位阻，阻止馬達(dá)區(qū)與微管的結(jié)合，進(jìn)而阻止KCBP沿微管運(yùn)動［3-5］，而藻類KCBP馬達(dá)區(qū)(KCBP motor domain，KMD)的晶體結(jié)構(gòu)未見報(bào)道。杜氏鹽藻KCBP含1 271個(gè)氨基酸殘基［6］，序列分析顯示在其C端存在典型的馬達(dá)區(qū)(881～1 215)和鈣調(diào)素結(jié)合螺旋(1 223～1 238)。為了進(jìn)一步研究KMD在生物體內(nèi)的功能，作者對杜氏鹽藻KMD進(jìn)行了原核表達(dá)，并純化該蛋白，為研究其晶體結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 杜氏鹽藻cDNA為該實(shí)驗(yàn)室保存，核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa，化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自全式金生物科技有限公司。LB培養(yǎng)基常規(guī)方法配置，使用前加入終質(zhì)量濃度為50 mg/L Kan。常規(guī)試劑購自Sigma和Amresco公司。層析填料、層析柱和AKTA Purifier購自GE公司。

1.2 KMD生物信息學(xué)分析 利用DNAman軟件預(yù)測目的蛋白pI，計(jì)算蛋白的相對分子質(zhì)量及在280 nm處的吸光度值，分析氨基酸組分。利用在線工具(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)分析目的蛋白稀有密碼子含有情況［7-8］。

1.3 表達(dá)載體pET28a-KMD的構(gòu)建與表達(dá)

1.3.1 載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)上游引物(5’-TTCCATAT AGAAGGGCAAGATCCGTGT-3’)和下游引物(5’-CCGGAATTCTTAGTCATTCTTGATGGTGCG-3’)，以杜氏鹽藻cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的片段。NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切目的片段和pET28a空載體，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物，16℃過夜連接，產(chǎn)物pET28a-KMD轉(zhuǎn)化Trans10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。雙酶切鑒定，提取陽性質(zhì)粒測序。

1.3.2 KMD試表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET28a-KMD轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，37℃過夜培養(yǎng)。任意挑取3個(gè)單克隆菌落接種于5 mL LB試管中，同時(shí)將3個(gè)單克隆菌落進(jìn)行平板劃線，繼續(xù)培養(yǎng)。試管于37℃振蕩培養(yǎng)至吸光度約0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)4 h。SDSPAGE檢測誘導(dǎo)前后目的蛋白表達(dá)情況。

1.3.3 KMD表達(dá)條件的優(yōu)化 培養(yǎng)10 mL菌液至吸光度約0.6，均分為2管(記為A和B)。均加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，A在37℃誘導(dǎo)4 h，B在16℃過夜誘導(dǎo)。分別取A、B誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后的上清液及沉淀行SDS-PAGE檢測。

1.3.4 KMD大量表達(dá) 挑取目的蛋白表達(dá)量較大的菌株接種于200 mL LB中37℃過夜培養(yǎng)，按照1∶40倍稀釋的接種量接種到8 L LB中擴(kuò)大培養(yǎng)。至吸光度約0.6時(shí)冷卻至16℃，加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG過夜誘導(dǎo)。5 000 r/min離心10 min收集菌體。

1.4 KMD的純化 用Buffer A(Tris 50 mmol/L、NaCl 500 mmol/L、MgCl22 mmol/L、ATP·Na20.1 mmol/L、咪唑20 mmol/L、β-巰基乙醇2 mmol/L，pH 7.5)重懸菌體，超聲破碎，18 000 r/min離心30 min后，取上清液進(jìn)行Ni離子親和層析，用Buffer A充分平衡層析柱，用含咪唑(300 mmol/L)的Buffer A洗脫目的蛋白。超濾法濃縮洗脫液，利用脫鹽柱(Fast Desalting Column HR 10/10)將蛋白更換至Buffer B(MES 25 mmol/L、NaCl 20 mmol/L、MgCl22 mmol/L、ATP·Na20.1 mmol/L、β-巰基乙醇2 mmol/ L，pH 6.5)中，再次濃縮。以Buffer B為低鹽緩沖液，Buffer C(MES 25 mmol/L、NaCl 1 mol/L、MgCl22 mmol/L、ATP·Na20.1 mmol/L、β-巰基乙醇2 mmol/ L，pH 6.5)為高鹽緩沖液過陽離子交換層析柱(Resource S)。收集目的峰濃縮后，用Buffer D(Tris 25 mmol/L、NaCl 100 mmol/L、MgCl22 mmol/L、ATP· Na20.1 mmol/L、β-巰基乙醇2 mmol/L，pH 7.5)過凝膠過濾層析柱(Supdex200 16/300)，收集目的峰，濃縮至20 g/L左右凍存于－80℃冰箱待用。

1.5 KMD穩(wěn)定性試驗(yàn) 取3份KMD分別存放于－80℃、4℃和18℃1周，SDS-PAGE檢測3份蛋白樣品。

2 結(jié)果

2.1 生物信息分析結(jié)果 DNAman分析顯示KMD的相對分子質(zhì)量為37 480，280 nm吸光度值為0.47，含有4個(gè)Cys，預(yù)測pI為7.99。大腸桿菌稀有密碼子含量分析顯示KMD基因序列中存在部分稀有密碼子，但沒有2個(gè)及2個(gè)以上稀有密碼子串聯(lián)出現(xiàn)。

2.2 pET28a-KMD的鑒定及表達(dá) 杜氏鹽藻cDNA PCR獲得約1 000 bp目的片段(圖1)。pET28a-KMD經(jīng)雙酶切鑒定，含有預(yù)期大小的片段(圖2)，測序結(jié)果顯示序列無誤，說明表達(dá)載體構(gòu)建成功。SDS-PAGE顯示在37℃下1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后KMD有表達(dá)，但不同克隆之間表達(dá)量存在差異，選擇表達(dá)量較大的菌株使用。KMD在37℃0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h仍有表達(dá)，且主要存在于沉淀之中。同樣IPTG濃度下，16℃過夜誘導(dǎo)則在上清液中有大量表達(dá)(圖3)。

2.3 KMD純化 親和層析獲得粗純目的蛋白，利用脫鹽柱去除蛋白中高鹽，電導(dǎo)檢測顯示目的蛋白成功脫鹽。KMD在MES pH 6.5緩沖液中可以結(jié)合在Resource S柱上，梯度洗脫時(shí)有2個(gè)明顯紫外吸收峰(圖4)。峰形對稱性良好，表明分子表面電荷均一，SDS-PAGE證實(shí)二者均為KMD。將二者分別過凝膠過濾層析柱，吸收峰對稱性均良好，出峰位置完全相同，表明二者分子均一，且有相同的聚合狀態(tài)。SDSPAGE顯示樣品中均以目的蛋白為主，表明兩者都具有較高純度(圖5)，能夠滿足結(jié)晶條件搜索試驗(yàn)。

3 討論

杜氏鹽藻 KMD含有335個(gè)氨基酸(881～1 215)，與擬南芥、土豆等高等植物同源性約為60%。高等植物KCBP的C端雖含有3個(gè)半胱氨酸，但晶體結(jié)構(gòu)中未見形成二硫鍵，推測鹽藻KMD沒有二硫鍵，但為了防止純化過程中半胱氨酸被氧化，故加入β-巰基乙醇。作者預(yù)測顯示KMD pI大于7，為堿性蛋白，故考慮使用pH 6.5的緩沖液，利用陽離子交換層析純化。KMD基因序列中雖含有部分稀有密碼子，但無串聯(lián)出現(xiàn)，提示稀有密碼子不影響KMD在BL21(DE3)中的表達(dá)。KMD經(jīng)37℃誘導(dǎo)后，主要以包涵體形式表達(dá)，當(dāng)溫度降至16℃過夜誘導(dǎo)時(shí)，上清液中有大量目的蛋白。

KMD為ATP水解蛋白，ATP或ATP類似物存在都有利于其穩(wěn)定存在。早期純化過程中未加入ATP，KMD表現(xiàn)為多聚狀態(tài)且易變性沉淀。加入ATP有利于蛋白保持單分子狀態(tài)，同時(shí)可長時(shí)間在4℃下存放而不沉淀。KMD離子交換層析顯示為2個(gè)明顯洗脫峰，SDS-PAGE證實(shí)二者都是目的蛋白，表明KMD存在2種表面電荷狀態(tài)。2種狀態(tài)的KMD凝膠過濾層析表現(xiàn)完全相同，結(jié)合出峰位置推測均為單分子狀態(tài)。

總之，該實(shí)驗(yàn)為解析鹽藻KMD晶體結(jié)構(gòu)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］Reddy AS，Safadi F，Narasimhulu SB，et al.A novel plant calmodulin-binding protein with a kinesin heavy chain motor domain［J］.J Biol Chem，1996，271(12):7052

［2］Deavours BE，Reddy AS，Walker RA.Ca2+/calmodulin regulation of the Arabidopsis kinesin-like calmodulin-binding protein［J］.Cell Motil Cytoskeleton，1998，40(4):408

［3］Reddy VS，Reddy AS.The calmodulin-binding domain from a plant kinesin functions as a modular domain in conferring Ca2+-calmodulin regulation to animal plus-and minus-end kinesins［J］.J Biol Chem，2002，277(50):48058

［4］ Vinogradova MV，Reddy VS，Reddy AS，et al.Crystal structure of kinesin regulated by Ca(2+)-calmodulin［J］.J Biol Chem，2004，279(22):23504

［5］Vinogradova MV，Malanina GG，Reddy VS，et al.Structural dynamics of the microtubule binding and regulatory elements in the kinesin-like calmodulin binding protein［J］.J Struct Biol，2008，163(1):76

［6］柳麗平，李杰，王翠，等.杜氏鹽藻cDNA文庫的構(gòu)建及KCBP基因的克?。跩］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，45 (6):907

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Expression and purification of KCBP motor domain from Dunaliella salina

XU Pengqi1)，LI Jie1)，ZHANG Hongmei2)，SHI Ke1)，HAN Kang1)，LI Mei2)，XUE Lexun1)1)Laboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500012)National Laboratory of Biomacromolecules，Institute of Biophysics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101

Dunaliella salina;kinesin-like calmodulin-binding protein;purification

Aim:To express and purify the kinesin-like calmodulin-binding protein motor domain(KMD)of Dunaliella salina by pET28a prokaryotic expression system and ion exchange and gel filtration chromatography.Methods:KMD cDNA was subcloned into the pET28a vector after physico-chemical property of KMD was analyzed using software and online tool.The supernatant expressing the recombinant KMD proteins was collected by using sonication and high-speed centrifuge，and then the purified proteins were obtained after affinity chromatograph，ion exchange chromatograph and gel filtration chromatograph.The proteins obtained from each step were evaluated by SDS-PAGE and kept at－80℃，4℃and 18℃for a week，respectively.Results:KMD proteins with the relative molecular weigh of 37 480 and pI of 7.99 were effectively expressed in BL21(DE3)regardless of its rare codon.After the multi-step chromatograph，two independent eluting peaks were shown，from which the KMD proteins were collected with high purity and stable quality after they were placed at 4℃and 18℃ for a week.Conclusion:Highly purified KMD has been obtained，which provides the qualified material in resolving KMD crystal structure.

Q786

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30700014;2009～2010年生物大分子國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題

(2011-03-10收稿 責(zé)任編輯趙秋民)