供體骨髓干細(xì)胞輸注聯(lián)合肝移植治療終末期肝病的近期效果觀察

江藝 張小進(jìn) 呂立志 楊芳 蔡秋程 潘凡

肝移植術(shù)后長期應(yīng)用免疫抑制劑是保持移植物長期存活的重要手段[1]。然而，這不僅增加受者沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也會誘發(fā)感染、腫瘤、肝腎功能損害和糖尿病等并發(fā)癥，部分患者仍發(fā)生排斥反應(yīng)。近年來，許多學(xué)者對通過何種手段既避免受者排斥移植器官的發(fā)生，又終止或減少免疫抑制劑的應(yīng)用進(jìn)行了諸多的研究，同源骨髓干細(xì)胞聯(lián)合器官移植是目前研究的熱點之一[2]。然而，實質(zhì)器官移植中，肝臟為所謂的 “免疫豁免”器官，其排斥反應(yīng)的發(fā)生輕于腎臟[3]，因此，同源骨髓干細(xì)胞聯(lián)合器官移植誘導(dǎo)免疫耐受的實驗研究，以及骨髓干細(xì)胞聯(lián)合腎臟移植的臨床研究受到了更早和更多的重視。研究證實，骨髓干細(xì)胞聯(lián)合腎臟移植受者對移植腎臟表現(xiàn)出免疫耐受，術(shù)后無需長期服用免疫抑制劑[4-5]。在動物實驗的基礎(chǔ)上，2008年3月至2009年1月本中心課題組開展了同期供體骨髓干細(xì)胞聯(lián)合肝臟移植8例，并與同期開展的常規(guī)肝移植患者進(jìn)行對比，報道如下。

對象與方法

一、病例選擇

2008年3月至2009年1月本中心行肝移植30例，其中8例同期供體骨髓干細(xì)胞聯(lián)合肝移植的受者為實驗組，其余僅行同種異體肝移植的22例受者為對照組。實驗組8例患者對實施同期供體骨髓干細(xì)胞輸注均知情同意，各例供者均為志愿捐贈的腦死亡者，受者對肝移植手術(shù)均知情同意，整個過程經(jīng)我院倫理委員會審批同意。兩組受者基本情況（表 1）。

二、方法

1.供體骨髓干細(xì)胞采集方法：參照馮曉勤等[6]的方法并適當(dāng)改進(jìn)：(1)腦死亡供者行肝腎聯(lián)合快速切取結(jié)束后，再次消毒雙側(cè)腹股溝區(qū)和臀外側(cè)，沿髂前上棘切開皮膚、皮下組織和肌肉，剔除附著在髂骨上的大部分肌肉，用骨科線鋸分別從左右側(cè)髂嵴上截取約8 cm×4 cm大小的髂骨塊各一，立即無菌保存于0～4℃ 300ml HTK 液（含有 1.25 萬單位肝素納）中運(yùn)送；(2)回手術(shù)室后，剝凈附著于髂骨的肌肉組織,咬骨鉗將髂骨咬成約 1 cm×1 cm 大小，500ml 乳酸鈉林格氏液洗滌 2 遍，再反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨變白。雙層紗布過濾洗滌液，置入50ml離心管中，4100×g離心10min收集骨髓細(xì)胞，棄上清，沉淀細(xì)胞用乳酸鈉林格氏液重懸，再經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心，純化單個核細(xì)胞，離心洗滌3次，收集沉淀的骨髓細(xì)胞，濾網(wǎng)過濾1次。一般每個供體可以獲得（1～5）×109個單個核細(xì)胞。將其加入含有 5﹪人血白蛋白的生理鹽水100ml中備用。

表1 兩組間病例資料均衡性檢驗結(jié)果

2.骨髓干細(xì)胞檢測：從上述制備好的 100ml 液體中取出 2ml 進(jìn)行檢測，有核細(xì)胞濃度為(1～5)×107/ml。流式細(xì)胞儀測定 CD34+細(xì)胞比例為1.5﹪～3.4﹪，推算采集的 CD34+細(xì)胞數(shù)為(3.5～14.0)×107/供體。

3.供體骨髓干細(xì)胞輸注：肝移植手術(shù)結(jié)束，生命體征平穩(wěn)后即可輸注與供肝同源的骨髓干細(xì)胞，每個受者輸注的單個核細(xì)胞數(shù)為 (1～5)×109個，經(jīng)中心靜脈輸注，輸注時間 1h。輸注過程同時觀察受者生命體征、是否出現(xiàn)皮疹等。

4.免疫抑制劑方案：兩組受者肝臟血流開放前靜滴甲潑尼龍 500 mg。對照組術(shù)后第 1 天甲潑尼龍 320 mg，以后每天遞減 40 mg，至 40 mg 后改口服潑尼松 20 mg，每天 1次。實驗組術(shù)后第 1 天甲潑尼龍 320 mg，以后每天遞減 80 mg，至 80 mg后改口服潑尼松 20 mg，每天 1次。兩組均于術(shù)后第 2 天開始口服他克莫司，對照組起始量 0.075 mg·kg-1·d-1，實驗組 0.05 mg·kg-1·d-1，以后根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整。若并發(fā)嚴(yán)重感染，則提前停用甲潑尼龍，他克莫司減量 50﹪以上。若發(fā)生排斥反應(yīng)，則適當(dāng)增加他克莫司用量，必要時甲潑尼龍 200 mg/d，沖擊治療 3 d。

5.觀測指標(biāo)：（1）免疫抑制劑用量：甲潑尼龍總量、出院時他克莫司劑量；（2）住院期間急性排斥反應(yīng)及感染并發(fā)癥發(fā)生情況；（3）肝功能恢復(fù)情況：術(shù)后第1、3、7天分別觀測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、血清總膽紅素（total bilirubin,TBil）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 (γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT)、白蛋白 (albumin,Alb) 等 ；（4）住院時間、住院費(fèi)用。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 11.0軟件分析，率的對比用確切概率法。兩均數(shù)間比較用t檢驗；成組設(shè)計多樣本均數(shù)的比較用兩因素方差分析，首先用Homogeneity of variance test進(jìn)行方差齊性檢驗，多樣本均數(shù)間的兩兩比較用SNK (Student Newman Keuls)法檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、治療結(jié)果

全部 30例受者手術(shù)成功，出院率 100﹪。實驗組受者骨髓干細(xì)胞輸注過程無不良反應(yīng)，亦未見明確的移植物抗宿主反應(yīng)。

二、免疫抑制劑用量

實驗組和對照組甲潑尼龍總用量分別為(1314±105)mg和(1884±256)mg，出院時他克莫司用量分別為(3.73±0.35)mg/d和(4.93±0.62)mg/d,實驗組甲潑尼龍總用量和出院時每日他克莫司用量均低于對照組（t'=8.635,5.147,P=0.000）。

三、急性排斥和感染發(fā)生情況

實驗組和對照組 3 個月內(nèi)急性排斥反應(yīng)發(fā)生率分別為 0﹪（0/8）和18.2﹪(4/22)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.314）。實驗組 3例（37.5﹪）發(fā)生感染，均為肺部細(xì)菌感染；對照組 10例（45.5﹪）發(fā)生感染，7例肺部感染，2例腹腔感染，1例膿毒血癥，均有細(xì)菌感染，其中 3例合并霉菌感染，兩組感染發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.978）。

四、肝功能恢復(fù)情況

術(shù)后第1天、第3天實驗組血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶均低于對照組，[術(shù)后第1天：谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶分別為 (875.2±325.5) IU/L ，(1350.4±482.7) IU/L，t=2.543，P=0.016,天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶分別為 (646.2±184.9) IU/L，(1021.8±325.4) IU/L，t=3.067，P=0.005。術(shù)后第 3 天，谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶分別為 (252.9±35.8) IU/L，(343.5±47.8) IU/L，t=4.866，P=0.000,天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶分別為(227.8±38.0) IU/L，(310.8±61.7) IU/L，t=3.545，P=0.001]術(shù)后第7天兩組間無顯著差異。兩組術(shù)后第1、3、7天血清總膽紅素、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和白蛋白差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

五、住院時間和費(fèi)用

實驗組和對照組住院時間分別為(24.6±10.5)d和(25.9±9.3)d；住院費(fèi)用分別為(22.5±3.5)萬元和(24.8±8.6)萬元。兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.328,t=1.040,P=0.746,P=0.307)。

表2 術(shù)后不同時間2組肝功能恢復(fù)情況（）

表2 術(shù)后不同時間2組肝功能恢復(fù)情況（）

注：ALT為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，AST天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶,TBil為血清總膽紅素，Alb為白蛋白，γ-GT為谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，與對照組相比，aP < 0.01

組 別 例數(shù) ALT（IU/L） AST(IU/L) TBil(g/L) Alb (g/L) γ-GT(μmol/L)第1天實驗組 8 875.2±325.5a 646.2±184.9a 69.6±34.3 29.4±4.2 98.5±31.1對照組 22 1350.4±482.7 1021.8±325.4 76.1±48.6 28.3±5.9 95.6±29.5第3天實驗組 8 252.9± 35.8a 227.8± 38.0a 85.6±38.3 34.2±9.2 115.9±36.5對照組 22 343.5± 47.8 310.8± 61.7 79.5±40.7 35.4±8.9 132.1±31.5第7天實驗組 8 72.1± 21.4 65.8± 18.4 58.2±26.5 38.2±8.2 94.9±35.7對照組 22 82.5± 24.0 79.4± 21.2 67.4±24.1 37.4±6.5 104.0±35.6

討 論

本研究結(jié)果顯示，接受同期骨髓干細(xì)胞輸注的肝移植受者術(shù)后免疫抑制劑用量明顯減少，早期肝細(xì)胞酶譜峰值更低，且未發(fā)生與骨髓干細(xì)胞輸注相關(guān)的并發(fā)癥。提示同期骨髓干細(xì)胞輸注有利于肝移植受者術(shù)后恢復(fù)。

一、骨髓來源干細(xì)胞與移植肝再生

骨髓是成體中干細(xì)胞含量最豐富的組織，包括多種具有向不同組織細(xì)胞分化潛能的干細(xì)胞群體，其中以造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSC)及間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)為主。骨髓來源干細(xì)胞(bone marrow-derived stem cells,BMDSC)同樣具有向肝內(nèi)細(xì)胞分化的潛能，而且認(rèn)為BMDSC是肝卵圓細(xì)胞的重要來源之一[7]。大量肝損傷動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓移植后2 d損傷肝內(nèi)即出現(xiàn)移植骨髓來源的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，而且隨著時間的推移，這樣的再生細(xì)胞也逐漸增多[8]。人類骨髓移植也得到了同樣的結(jié)果，BMDSC參與實質(zhì)細(xì)胞再生的效率可達(dá)40﹪，其中丙型肝炎肝損傷最重，BMDSC參與再生效率也最高[9]。部分肝切除一直是研究肝再生的經(jīng)典模型，F(xiàn)ujii等[10]研究證實，70﹪肝切除后移植的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）標(biāo)記的骨髓細(xì)胞，有70﹪參與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(sinusoidal endothelia- lcells,SEC)的再生，而肝臟SEC在肝切除早期可以誘導(dǎo)增殖狀態(tài)的肝細(xì)胞及靜息狀態(tài)的肝細(xì)胞增殖。以上研究證實，BMDSC既可以直接參與肝實質(zhì)細(xì)胞再生，也可以通過參與非實質(zhì)細(xì)胞再生而促進(jìn)肝功能恢復(fù)。本研究在肝移植術(shù)后數(shù)小時內(nèi)將供者來源的骨髓干細(xì)胞一次性輸注給受者，術(shù)后肝功能恢復(fù)更快，可能由于部分供體干細(xì)胞直接參與再灌注損傷肝臟的再生與修復(fù)。

二、供者來源BMDSC與移植肝耐受

有報道顯示，大約20﹪的肝移植受者對移植肝可以產(chǎn)生自發(fā)免疫耐受，從而停止免疫抑制劑的應(yīng)用，但是尚無法證實這些病例移植后不使用免疫抑制劑是安全的[11]。Mellgren等[12]和Susanne等[13]分別在應(yīng)用CD34+干細(xì)胞治療先天遺傳病和血液病后，由于受者肝功能衰竭而進(jìn)行同一供者來源的活體肝移植(living donor liver transplantation,LDLT)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植肝耐受的發(fā)生，且移植后只需要小劑量應(yīng)用免疫抑制劑，甚至可以完全停用。由此認(rèn)為，同一供者來源的干細(xì)胞輸注在誘導(dǎo)移植肝免疫耐受中發(fā)揮了重要作用。但是，輸注之前應(yīng)用放射或化學(xué)藥物進(jìn)行骨髓抑制處理，會對機(jī)體造成毒性損傷，而且，造血干細(xì)胞輸注有引起移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的危險，在某種程度上限制了這一方法的應(yīng)用。2004年，Donckier等[14]在給2例肝病患者行LDLT前，沒有進(jìn)行骨髓抑制，而是先給受者輸注HLA配型不符的供者來源CD34+細(xì)胞，然后分別在輸注后第40 和55 天實施LDLT，結(jié)果誘導(dǎo)了供者特異性的免疫耐受，使肝移植物長期存活，而且沒有觀察到移植物抗宿主?。╣raft-versus-host diseaes,GVHD）的發(fā)生，證明HSC在這一治療中起到了關(guān)鍵作用。2006年，Donckier等[15]又進(jìn)行了LDLT之后第7天輸注同一供者來源的干細(xì)胞的研究，也得到了同樣的結(jié)果，而且在術(shù)后早期停止了免疫抑制治療。以上報道中所輸注的CD34+干細(xì)胞均是從G-CSF動員后的供者外周血中收集而來，而成體中骨髓的HSC含量最豐富，故認(rèn)為這些細(xì)胞最可能來源于骨髓。本研究是直接從供體髂骨中采集骨髓干細(xì)胞，獲得的單個核細(xì)胞的數(shù)量充足，通常可以達(dá)到1×109個以上。移植后實驗組免疫抑制劑用量顯著減少，而且無明確的排斥反應(yīng)發(fā)生，感染發(fā)生率較對照組為低。隨著病例數(shù)量的增加和觀察時間的延長，可能會獲得出更為滿意的結(jié)果。

同期供體骨髓干細(xì)胞是一種安全有效的治療方法。為了在臨床推廣應(yīng)用供體骨髓干細(xì)胞輸注聯(lián)合肝臟移植這一新技術(shù)，除了保證供體骨髓干細(xì)胞采集和提取過程的絕對無菌、供受體血型相符外，尚需深入研究供體骨髓干細(xì)胞對肝移植受者免疫系統(tǒng)的影響，以及輸注時機(jī)和輸注方式等問題。

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