成人胰島細(xì)胞移植25例次臨床研究

譚建明 楊順良 蔡錦全 吳衛(wèi)真 郭君其 黃梁滸 王慶華 吳志賢 陳津

糖尿病源于胰島素分泌絕對(duì)缺乏或相對(duì)缺乏，各種類型的胰島細(xì)胞移植一直是臨床研究的熱點(diǎn)[1]。加拿大科學(xué)家報(bào)道的新型胰島細(xì)胞分離純化技術(shù)和無激素免疫抑制方案，使成人胰島細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用成為可能[2]?，F(xiàn)將我院25次成人胰島細(xì)胞移植臨床資料總結(jié)報(bào)道如下。

對(duì)象與方法

一、臨床資料

2006年至2007年在福州總醫(yī)院就診的1型糖尿病( type 1diabetes,T1DM )14例，男7例、女7例，年齡14～48歲(中位年齡33.5歲)。臨床確診T1DM病程9～26年(平均18.3年)，均有1次以上低血糖癥狀，指血糖水平≤3.0 μmol/L。0.1ng/ml<空腹C肽≤ 0.25 ng/ml，0.1ng/ml < 餐后2h C肽≤0.35 ng/ml。術(shù)前胰島素用量36～66 U，平均52 U。

二、成人胰島細(xì)胞分離與純化

按 Ricordi 報(bào)道的方法[3]加以改進(jìn)。包括供胰置于全氟化碳液( PFC )和威斯康星大學(xué)器官保存液( UW液)雙層冷藏，新型Liberase酶消化，COBE2991型專用胰島細(xì)胞分離機(jī)分離及連續(xù)密度梯度純化，短期(24～36 h)培養(yǎng)等[4](圖1～4)。

三、移植方法

圖1 成人胰腺修剪后，Liberase酶灌注消化

圖2 消化胰腺組織

圖3 分離純化后，獲取的胰島細(xì)胞

圖4 DTZ染色后的胰島細(xì)胞

經(jīng)門靜脈將胰島細(xì)胞移植到肝臟內(nèi)。移植途徑：采用上腹部小切口，分離胃右靜脈或臍靜脈，插入16號(hào)導(dǎo)管針進(jìn)入門靜脈內(nèi)。證實(shí)導(dǎo)管針進(jìn)入門靜脈、測(cè)門靜脈壓力。收集胰島細(xì)胞裝入移植專用袋，加入200ml移植用培養(yǎng)液，按患者體重加入肝素；另一小袋加入50ml移植用培養(yǎng)液，以備沖洗。將胰島細(xì)胞輸注入門靜脈內(nèi)，總體積250ml，輸注時(shí)間30min，密切觀察患者反應(yīng)。輸注結(jié)束后，再次測(cè)門靜脈壓力。輸注前后，門靜脈壓力無明顯升高，波動(dòng)在15～20 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)(圖5～7)。

四、免疫抑制治療方案

以雷帕霉素和小劑量他克莫司組成二聯(lián)免疫抑制治療方案。雷帕霉素前10d按 0.2 mg/kg，血藥濃度谷值控制在12～15 ng/ml，此后1個(gè)月，按0.1 mg/kg調(diào)整劑量，血藥濃度谷值控制在8～10 ng/ml，1個(gè)月后根據(jù)血藥濃度(控制在7 ng/ml左右)調(diào)整劑量。他克莫司2～3 mg/d 維持，濃度控制在3～5 ng/ml。

圖5 找到臍靜脈后，鈍性分離，插入16號(hào)導(dǎo)管，以備輸注胰島細(xì)胞

圖6 術(shù)中超聲證實(shí)導(dǎo)管位于肝臟門靜脈內(nèi)

圖7 胰島細(xì)胞移植中

免疫誘導(dǎo)治療方案：采用塞尼哌( Zenapax ) 50 mg，術(shù)前24 h、術(shù)后每2周1次，共5次?；駽ampath-1H 15 mg，術(shù)前24 h、術(shù)后24 h各靜脈滴注，共2次，總量30 mg。Campath-1H目標(biāo)控制指標(biāo)為外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)控制在50個(gè)/ml內(nèi)[5]。

五、術(shù)后觀察項(xiàng)目

術(shù)后2 d，每2～4 h監(jiān)測(cè)血糖1次，恢復(fù)正常飲食后，餐前、餐后2h及睡前各測(cè)血糖1次。術(shù)后24 h彩色多普勒超聲監(jiān)測(cè)肝臟和門靜脈系統(tǒng)。每周測(cè)空腹C肽、餐后C肽、血常規(guī)和肝腎功能，每2～3個(gè)月檢測(cè)糖化血紅蛋白、胰島素抗體，每周監(jiān)測(cè)免疫抑制劑血藥濃度，穩(wěn)定后每個(gè)月1～2次。

六、隨訪

前3個(gè)月每周隨訪1次，此后每個(gè)月1次，1年后每3個(gè)月1次。隨訪時(shí)間：所有患者均超過18個(gè)月，其中超過3年8例，最長隨訪時(shí)間6年。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，餐前后C肽量差異采用配對(duì) t 檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胰島細(xì)胞分離純化結(jié)果

福州總醫(yī)院和上海市第一人民醫(yī)院共分離胰腺47個(gè)，分離純化后胰島細(xì)胞得率除1例為6.9萬胰島當(dāng)量( islet equivalents，IEQ )外，均超過10萬IEQ。胰島細(xì)胞數(shù)量10.5～79.0萬 IEQ，平均32.5萬IEQ；純度65.0﹪～95.4﹪，平均81.4﹪；活率90﹪～98﹪，平均93.2﹪；胰島功能刺激指數(shù)(stimulating index,SI)為2.1～5.07，平均3.26。病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果均為陰性。45個(gè)胰腺分離的胰島細(xì)胞用于臨床移植，每次移植使用的同血型胰腺數(shù)為：1個(gè)胰腺6次、2個(gè)胰腺17次、3個(gè)胰腺2次，另2個(gè)胰腺因血型不符胰島細(xì)胞棄用。

二、移植次數(shù)與胰島數(shù)量

14例患者中6例移植1次(例2、例7、例10、例11、例12、例14)，其中例7術(shù)后34 d完全撤除胰島素至今，另5例因個(gè)人原因或胰島來源受限未行第2次移植，胰島素均減量60﹪。6例移植2次(例3、例4、例6、例8、例9、例13)，其中5例完全撤除胰島素，另一例每日胰島素用量12 U。2例移植3次(例1、例5)，均完全撤除胰島素(表1)。移植胰島細(xì)胞數(shù)量：45～76萬IEQ，按體重計(jì)算為:7485～16774 IEQ/kg，平均10200 IEQ/kg。

三、血糖與 C 肽檢測(cè)結(jié)果

正常飲食后，達(dá)到空腹與餐后血糖正常范圍(空腹6.1mmol/L、餐后2h 8.0mmol/L)所需胰島素用量見表1。其中8例完全撤除胰島素，6例胰島素減量均超過60﹪。總有效率100﹪，胰島素撤除率57.1﹪(8/14)。

空腹與餐后C肽檢測(cè)值波動(dòng)較大?？崭笴肽均在0.5 ng/ml以上，波動(dòng)在0.5～2.3 ng/ml；餐后2 h C肽均在0.8 ng/ml以上，波動(dòng)在0.82～3.5 ng/ml。以C肽≥0.5 ng/ml為標(biāo)準(zhǔn)，C肽陽性率100﹪。與術(shù)前比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.500，P=0.000，表2)。

表1 14例1型糖尿病患者胰島移植后不同時(shí)期胰島素用量變化及撤除情況

表2 14例1型糖尿病患者胰島移植后不同時(shí)期C肽含量比較

糖化血紅蛋白( HbA1c )檢測(cè)結(jié)果： 6例移植胰島素減量患者，HbA1c波動(dòng)于6.5﹪～7.5﹪。其他患者均在6.5﹪以下，波動(dòng)于5.2﹪～6.5﹪。胰島移植前，糖化血紅蛋白為9.121﹪±1.255﹪，移植后末次為6.243﹪±0.680﹪(t’=7.547，P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、肝、腎功能檢測(cè)結(jié)果

14例25次胰島細(xì)胞移植前后，肝功能指標(biāo)一直維持在正常水平。8例并發(fā)尿毒癥患者，腎臟與胰島細(xì)胞聯(lián)合移植后，移植腎功能均在5 d內(nèi)恢復(fù)正常。此后，所有患者血肌酐穩(wěn)定維持在正常水平，未出現(xiàn)移植腎臨床排異反應(yīng)。術(shù)后彩色多普勒超聲監(jiān)測(cè)肝臟和門靜脈系統(tǒng)未見異常(圖8，9)。

圖8 術(shù)后彩色多普勒超聲監(jiān)測(cè)肝臟和門靜脈系統(tǒng)未見異常

圖9 術(shù)后彩色多普勒超聲監(jiān)測(cè)肝臟和門靜脈系統(tǒng)未見異常（局部放大圖像）

五、并發(fā)癥

Campath-1H應(yīng)用后，外周血淋巴細(xì)胞均降至50個(gè)/ml以下，絕大多數(shù)降至10～20個(gè)/ml，持續(xù)1～3個(gè)月，但并未增加感染發(fā)生率。應(yīng)用大劑量雷帕霉素后，3例患者出現(xiàn)明顯口腔潰瘍，調(diào)整劑量后逐漸愈合。所有患者均有血脂水平升高，需加用降脂藥物(非諾貝特膠囊或氟伐他汀鈉膠囊)。未發(fā)生與胰島輸注相關(guān)的并發(fā)癥。

討 論

胰島細(xì)胞移植治療糖尿病已有近百年的歷史[6]。但無論是異種來源的胰島細(xì)胞、胎胰組織，還是手工分離的同種異體胰島細(xì)胞移植，其臨床效果均不理想。直到Ricordi等[3]報(bào)道胰島細(xì)胞半自動(dòng)分離純化方法和Shapiro等[2]報(bào)道無激素免疫抑制方案后，才得以在臨床應(yīng)用，并取得了撤除胰島素的療效。

獲得足量、高純度與高活性的成人胰島細(xì)胞是移植成功的基礎(chǔ)膠囊。因此，實(shí)驗(yàn)室分離純化技術(shù)與經(jīng)驗(yàn)積累是關(guān)鍵。本組研究采用 UW與PFC雙層保存，為胰腺提供足夠的氧，使冷藏時(shí)間延長到 12h 以上；采用新型 Liberase 酶消化胰腺，COBE2991 型胰島細(xì)胞分離機(jī)和連續(xù)密度梯度方法分離與純化胰島細(xì)胞，絕大多數(shù)一個(gè)胰腺可獲取25萬IEQ以上的胰島細(xì)胞。盡管與一個(gè)胰腺具有100萬IEQ以上胰島細(xì)胞相差甚遠(yuǎn)，但2個(gè)胰腺就可分離到一個(gè)患者所需的胰島細(xì)胞。近期Hering等[8]報(bào)道采用單供體，獲得胰島細(xì)胞7271 IEQ/kg體重，并取得了8例患者中5例撤除胰島素超過1年的臨床結(jié)果。筆者實(shí)驗(yàn)室近期連續(xù)5個(gè)胰腺分離出超過50萬IEQ的胰島細(xì)胞，有望達(dá)到一個(gè)胰腺分離的胰島細(xì)胞移植一個(gè)患者的目標(biāo)。

免疫抑制治療方案的選擇是成人胰島細(xì)胞移植的關(guān)鍵。以鈣調(diào)磷酸酶抑制劑和皮質(zhì)激素為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)免疫抑制方案，具有明顯的胰島毒性，引起胰島細(xì)胞凋亡，顯著降低胰島素分泌功能。而早期大幅度減少鈣調(diào)磷酸酶抑制劑的劑量，不用皮質(zhì)激素，移植物排異反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)極大。通過前期的研究[4,7]，本組采用Campath-1H誘導(dǎo)，大劑量雷帕霉素和小劑量他克莫司治療方案，全程避免應(yīng)用皮質(zhì)激素，即可有效地預(yù)防移植物排異反應(yīng)，又無明顯胰島細(xì)胞毒性損害。臨床結(jié)果顯示：14例患者中，8例完全撤除了胰島素，另6例患者胰島素減量60﹪以上，血糖均控制在正常水平。臨床療效已超過Edmonton方案協(xié)作組36例成人胰島細(xì)胞移植未用Campath誘導(dǎo)1年隨訪胰島素撤除率44﹪(16/36)、部分有效(胰島素減量)28﹪(10/36)的結(jié)果[9]。

與胰腺移植相比，成人胰島細(xì)胞移植更加安全，手術(shù)簡(jiǎn)捷，并發(fā)癥極少，并可重復(fù)進(jìn)行。本組14例25次胰島細(xì)胞移植，無論是單次移植，還是3次移植，除極少數(shù)出現(xiàn)免疫抑制劑的相關(guān)副作用外，均未發(fā)生其他并發(fā)癥。1年短期療效已接近胰腺移植，C肽陽性率100﹪。本組病例的另一個(gè)顯著的特點(diǎn)是胰島移植后無論是否撤除胰島素，只要C肽陽性，均有利于糖尿病胰島素治療效果的改善并使血糖穩(wěn)定在正常水平。長期臨床效果，以及是否有利于防止并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展等，有待進(jìn)一步觀察。

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