不同方法分離的成人睪丸支持細(xì)胞與胰島共移植的效果對比

李楊 薛武軍 田曉輝 宋煥瑾 宋勇 丁小明 馮新順 丁晨光

睪丸支持細(xì)胞(sertoli cell)是曲細(xì)精管內(nèi)惟一的體細(xì)胞，具有為生精細(xì)胞提供支架、營養(yǎng)、激素轉(zhuǎn)化、屏障隔離和吞噬的作用，對睪丸功能及精子發(fā)生至關(guān)重要[1]。近年隨著基礎(chǔ)研究的逐漸深入，越來越多的資料表明，Sertoli 細(xì)胞是睪丸產(chǎn)生免疫豁免的功能細(xì)胞[2]，Saporta等[3]將豬和大鼠的 Sertoli 細(xì)胞分別移植入大鼠大腦后發(fā)現(xiàn) Sertoli 細(xì)胞至少可以存活2個(gè)月而不需要環(huán)孢素A。從而認(rèn)為 Sertoli 細(xì)胞可以在睪丸以外的移植部位產(chǎn)生足夠的免疫抑制效應(yīng)而不需額外的免疫抑制治療。此外，Sertoli 細(xì)胞免疫原性較低，還能分泌多種免疫保護(hù)因子和營養(yǎng)因子，促進(jìn)周圍細(xì)胞的生長[4-6]，降低移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)[7]。Sertoli 細(xì)胞的功能研究已拓展到器官移植的領(lǐng)域，近年來，有學(xué)者將支持細(xì)胞與胰島體外共培養(yǎng)或者共同移植，能夠改善胰島功能，降低免疫排斥反應(yīng)，延長移植物存活[8-9]。隨著胰島移植技術(shù)的開展，對 Sertoli 細(xì)胞的需求越來越高，而目前對 Sertoli 細(xì)胞的分離尚無統(tǒng)一的方法。國內(nèi)外對 Sertoli 細(xì)胞的研究大多采用未成熟的嚙齒動(dòng)物作原代培養(yǎng)，而且方法復(fù)雜、繁瑣，對成人 Setoli 細(xì)胞的報(bào)道很少，近年來僅有滕琰等[10]報(bào)道成人睪丸 Sertoli 細(xì)胞的分離。本研究擬用不同的方法對成人睪丸 Sertoli 細(xì)胞進(jìn)行分離和純化，并觀察其與胰島共移植的效果，以尋求一種簡便、快捷和高效的 Sertoli 細(xì)胞分離的方法。

材料和方法

一、材料

睪丸和胰腺組織取自志愿捐贈的成年男性尸體，共 10例，年齡25～35歲，無相關(guān)疾病的病史。0～4℃用無菌離體器官保存液(HCA)保存運(yùn)輸，熱缺血時(shí)間<15min，冷缺血時(shí)間 3～8h。BALB/C小鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。胰蛋白酶、膠原酶V、透明質(zhì)酸酶及 DNA 酶Ⅰ均為Sigma公司產(chǎn)品。DMEM /F12和RPMI-1640液體培養(yǎng)基均為美國Gibco公司產(chǎn)品，特級胎牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品。小鼠抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體為美國Santa cruz公司產(chǎn)品。SABC 檢測試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品。FITC標(biāo)記的鼠抗人FasL單克隆抗體為ABCOM公司產(chǎn)品。

二、睪丸支持細(xì)胞的分離純化

用 4 ℃ 的 Hank 液沖洗睪丸，去除被膜及血管，再以眼科鑷挑出生精小管,盡量剝除生精小管周圍的間質(zhì)組織并剪碎，將睪丸組織隨機(jī)分為3組，每組睪丸組織質(zhì)量相同。A組：2.5 g/L 胰蛋白酶、5 g/L 膠原酶V、1 g/L 透明質(zhì)酸酶和0.4 g/L DNA酶于37℃恒溫水浴箱消化30min，含10﹪胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，用 4 ℃ 的 Hank 液洗滌3 遍，離心去上清液。B組：2.5 g/L 胰蛋白酶和0.4 g/L DNA酶I于37℃恒溫水浴箱消化30min，冷Hank液洗滌3遍，離心去上清液，5 g/L 膠原酶Ⅴ于37℃恒溫水浴箱中消化20min、冷 Hank液洗滌 3 遍，離心去上清液， 1.5 g/L 膠原酶 V、1 g/L 透明質(zhì)酸酶 37 ℃ 消化 20min，含 100ml/L 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化，100目的篩網(wǎng)過濾后，無血清DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次后，離心去上清液。C組：2.5 g/L胰蛋白酶、0.4 g/L DNA酶I于37℃水浴消化15min，含100ml/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止胰酶反應(yīng)，離心去上清液，1 g/L透明質(zhì)酸酶37℃水浴消化30min，無血清培養(yǎng)基洗滌 2次，離心去上清液，5 g/L 膠原酶Ⅴ于37℃水浴消化 20min，含100ml/L胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，100目的篩網(wǎng)過濾，無血清DMEM/F12 培養(yǎng)基洗滌3次后，離心去上清液。上述3組分離方法所得的沉淀物均重懸于含 200ml/L 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基中，于39℃、50ml/L CO2培養(yǎng)箱中孵 48h。更換培養(yǎng)液，于相同條件下繼續(xù)孵育 8h 后，更換無血清的培養(yǎng)液。20mmol/L Tris-HCl 緩沖液( pH 7.0 )對細(xì)胞進(jìn)行 5min 的低滲處理,最后于37℃、50ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

三、睪丸支持細(xì)胞的鑒定

1.倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)特征：將培養(yǎng)的 Sertoli 細(xì)胞定期在倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)、大小等特征，估算其在培養(yǎng)細(xì)胞中所占的比例。

2.電子顯微鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)：Sertoli 細(xì)胞純化后體外培養(yǎng) 48h，0.25﹪胰酶消化后收集培養(yǎng)的 Sertoli 細(xì)胞，2.5﹪戊二醛固定液預(yù)固定、鋨酸后固定、脫水、包埋、半薄切片定位和超薄切片等步驟后，在透射電子顯微鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)行鑒定。

3.免疫組化染色：80﹪冰丙酮固定 Sertoli 細(xì)胞爬片，用SABC免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測支持細(xì)胞上波形蛋白的表達(dá)。

四、睪丸支持細(xì)胞的活性檢測

分別于培養(yǎng)后 3、7、14、21 和28 d，取細(xì)胞密度為 5×105個(gè) /ml 的細(xì)胞懸液 0.5ml，加入MTT應(yīng)用液0.5ml，于37℃水浴中孵育4 h，離心去上清液，加入異丙醇劇烈震蕩，使管底部的紫色沉淀完全溶解后，離心半徑7.5 cm，2000 r/min離心5min，收集上清液，于波長570 nm以DMEM /F12培養(yǎng)液調(diào)零比色，測定吸光度(A)值。

五、睪丸支持細(xì)胞純度的測定

將培養(yǎng) 3 d 后的 Sertoli 細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，加入FasL-FITC流式抗體作用15min，流式細(xì)胞儀檢測FasL(+)細(xì)胞數(shù)。

六、胰島的分離純化

采用半自動(dòng)灌注過濾法用1.5 g/L的膠原酶Ⅴ消化胰腺，采用cobe2991細(xì)胞分離儀，通過連續(xù)密度梯度離心的方法進(jìn)行胰島的純化。分離和純化的胰島懸浮于含100ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、50ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

七、糖尿病鼠模型胰島與睪丸支持細(xì)胞共移植

BALB/C小鼠禁食 20 h，不禁水，新鮮配制的鏈脲霉素自尾靜脈注入，給藥劑量為250 mg/kg。注入前及注入后每天尾靜脈取血，測定血糖濃度。當(dāng)血糖濃度連續(xù)≥20.0mmol/L超過 5 d，即可作為成功的糖尿病模型。糖尿病模型鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，將胰島和Setoli 細(xì)胞按下面的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法移植到糖尿病鼠的腎包膜下。A組：胰島和方法A分離的 Sertoli 細(xì)胞聯(lián)合移植到腎包膜下。B組：胰島和方法B分離的 Sertoli 細(xì)胞聯(lián)合移植到腎包膜下。C組：胰島和方法C分離的 Sertoli 細(xì)胞聯(lián)合移植到腎包膜下。D組：單獨(dú)移植胰島到腎包膜下。移植術(shù)前先用2.5 g/L胰酶消化后收集培養(yǎng)的 Sertoli 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/ml，同時(shí)選取1000 IEQ胰島用于移植。糖尿病模型鼠按40 mg/kg的劑量進(jìn)行戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉滿意后，采用無菌操作程序打開腹腔找到左右腎臟，浸有生理鹽水的敷料墊起腎下極，無菌注射器針尖將腎上極的包膜挑起，先注入少量空氣使腎包膜鼓起1個(gè)小包，再將移植的細(xì)胞置入注射器內(nèi)推入腎包膜內(nèi)。燒灼封閉腎包膜的刺口，關(guān)腹。移植次日起尾靜脈采血測定血糖濃度。以血糖濃度≤11.1mmol/L，持續(xù)2 d以上作為移植物功能存活的標(biāo)準(zhǔn)；以血糖濃度≥20.0mmol/L并超過3 d，作為移植物被排斥、功能喪失的指標(biāo)。記錄血糖第1次升高的時(shí)間作為移植物存活時(shí)間。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 11.5軟件分析處理，采用t檢驗(yàn)和Fisher精確概率法檢驗(yàn)比較各組間差異，胰島移植術(shù)后對胰島移植效果進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、睪丸支持細(xì)胞的鑒定

培養(yǎng) 48h后，倒置相差顯微鏡下可見 Sertoli 細(xì)胞完全貼壁生長，胞體增大呈多角形，大多有3個(gè)以上的突起。細(xì)胞質(zhì)中脂滴含量豐富，可見吞噬的小顆粒狀物質(zhì)。細(xì)胞核清晰可見，位于胞體中央或稍偏位，呈圓形或橢圓形，其長軸方向與細(xì)胞的方向一致(圖1，2)。

波形蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示：Sertoli 細(xì)胞免疫化學(xué)染Vimentin呈陽性反應(yīng)。Vimentin呈棕黃色分布，由核周的細(xì)胞質(zhì)呈輻射狀向四周胞膜伸展，直到細(xì)胞膜(圖3，4)。

透射電鏡下觀察可見： Sertoli 細(xì)胞胞質(zhì)為中等密度的基質(zhì)，含有豐富的線粒體、高爾基體、粗面和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及溶酶體、分泌顆粒、較多的脂肪顆粒和包涵物。胞質(zhì)中尚有許多微管和微絲，呈束狀與細(xì)胞長軸平行。Sertoli 細(xì)胞的細(xì)胞核多呈卵圓形，伴有核膜不規(guī)則的皺褶或小凹，核孔在皺褶內(nèi)，核內(nèi)常染色質(zhì)豐富，缺乏同源染色質(zhì)的周圍塊。胞核最突出的特征是具有明顯的核仁和其周圍的衛(wèi)星核小體(圖5)。

二、不同方法分離的睪丸支持細(xì)胞的活性比較

3種方法分離的 Sertoli 細(xì)胞培養(yǎng) 28 d 的活性變化如圖6所示。應(yīng)用方法A和B分離的

Sertoli 細(xì)胞，在體外培養(yǎng) 7 d 時(shí)細(xì)胞活性最高，以后隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸下降，B組的細(xì)胞活性在體外培養(yǎng)3 d時(shí)與A組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.26，P=0.80)，但是B組的細(xì)胞活性在體外培養(yǎng) 7、14、21和28 d時(shí)均明顯高于A組(t’=2.89，P < 0.05；t=4.02，P=0.00；t=2.77，P=0.01；t=3.09，P=0.00)；應(yīng)用方法C分離的 Sertoli 細(xì)胞，在體外培養(yǎng) 14 d時(shí)細(xì)胞活性最高，而體外培養(yǎng)3和7 d時(shí)細(xì)胞活性明顯低于A組和B組(t=2.97，2.36，P=0.00，0.03；t=3.05，8.89，P=0.00，)，但 14、21、28 d時(shí)細(xì)胞活性與 A組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t’=0.52，P > 0.05；t=0.32，P=0.75；t=1.03，P=0.32），但明顯低于B組 （ t’=2.88，P < 0.05 ；t=3.05，P=0.00 ；t=3.83，P=0.00）。

圖1 Sertoli 細(xì)胞體外培養(yǎng)48h(×100)

圖2 Sertoli 細(xì)胞體外培養(yǎng)48h(×200)

圖3 體外培養(yǎng)的 Sertoli 細(xì)胞波形蛋白表達(dá)陽性（免疫組化染色×100）

圖4 體外培養(yǎng)的 Sertoli 細(xì)胞波形蛋白表達(dá)陽性（免疫組化染色×400）

圖5 透射電鏡下的 Sertoli 細(xì)胞（免疫組化染色×8000）

三、不同方法分離的睪丸支持細(xì)胞的純度比較

流式細(xì)胞儀檢測FasL(+)細(xì)胞數(shù)的結(jié)果顯示：應(yīng)用3種不同的方法分離的 Sertoli 細(xì)胞的純度分別為(85.17±1.8)﹪、(92.33±2.5)﹪和(93.12±2.6)﹪，B組和C組的細(xì)胞純度均明顯高于A組(t=7.35，P < 0.00；t=7.95，P < 0.00)，B組和C組的細(xì)胞純度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.69，P=0.50)。

四、移植胰島的生存分析

對不同組的胰島移植術(shù)后觀察 28 d，結(jié)果表明D組單獨(dú)移植的胰島平均生存時(shí)間為(5±0.7)d，A組和C組移植術(shù)后胰島的平均存活時(shí)間分別為(11±1.3) d和(19±2.6) d，而B組胰島移植術(shù)后出現(xiàn)截尾值2例(即在觀察時(shí)間結(jié)束時(shí)2例終止事件尚未發(fā)生)。經(jīng)log-rank檢驗(yàn)，各組平均存活時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=165.548，P=0.000， 圖7)。

討 論

圖6 不同方法分離的 Sertoli 細(xì)胞的活性比較

圖7 A、B、C、D四組胰島移植生存分析

研究表明，將表達(dá)FasL的 Sertoli 細(xì)胞與移植物共移植科顯著延長移植物在體內(nèi)的存活時(shí)間[11-12]。構(gòu)建胰島移植中免疫豁免環(huán)境的關(guān)鍵是分離出高活性和高數(shù)量的 Sertoli 細(xì)胞與胰島共移植。目前使用的大多是從睪丸組織中分離出的原代 Sertoli 細(xì)胞，由于Sertoli 細(xì)胞在青春期發(fā)育過程中即停止分裂，細(xì)胞數(shù)相對較少，成年動(dòng)物睪丸的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，生精細(xì)胞占絕大多數(shù)。因此目前研究人員大多采用未成年的個(gè)體，再將結(jié)果推延至成熟個(gè)體[13]，而且分離方法均較復(fù)雜繁瑣，操作步驟多，所需時(shí)間長，Sertoli 細(xì)胞的純度也只達(dá)到了80﹪[10]，而且成熟和未成熟細(xì)胞功能之間也存在差異[14]。因此建立一種簡單有效Sertoli 細(xì)胞分離培養(yǎng)方法迫在眉睫。

目前采用的分離方法，主要是通過使用不同的消化酶對睪丸進(jìn)行消化，然后對消化產(chǎn)物進(jìn)行一系列處理而將Sertoli 細(xì)胞分離出來。但目前的研究報(bào)道對所用酶的濃度及使用的先后順序、消化的時(shí)間等條件沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本研究在參考了國內(nèi)外有關(guān)培養(yǎng)動(dòng)物支持細(xì)胞的基礎(chǔ)上，總結(jié)選擇了最常見3種消化分離的方法進(jìn)行分離效果的對比，它們的消化酶的種類和濃度均相同，只是消化酶使用的次序有所不同。形態(tài)學(xué)和免疫組化鑒定結(jié)果顯示，3種方法分離出的細(xì)胞方法均能分離一定的數(shù)量和純度的Sertoli 細(xì)胞，但存在一定的差異，且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同的分離方法對細(xì)胞活性有顯著的影響。三步法由于消化的步驟多，細(xì)胞受到消化酶較長時(shí)間的作用而發(fā)生損傷，因此，分離得到的細(xì)胞活性較差，需要較長時(shí)間的恢復(fù)，恢復(fù)的程度有限，故活性最低而且峰值延遲。而一步法雖然消化步驟最少，時(shí)間最短，但是分離得到的細(xì)胞中，除了 Sertoli 細(xì)胞外，還有其他許多細(xì)胞，如生精細(xì)胞等，這些細(xì)胞會相互影響，從而降低的他們的活性。而兩步法在消化步驟和消化時(shí)間上比較適中，先采用胰酶和DNA酶消化細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，使細(xì)胞分離，再使用膠原酶和透明脂酸酶去除平滑肌樣細(xì)胞，并將大部分的曲細(xì)精管消化開，獲得的Sertoli 細(xì)胞純度也比較高，其他雜質(zhì)較少，這可能是其活性最高的原因。流式細(xì)胞儀對FasL(+)細(xì)胞數(shù)量檢測同樣顯示，一步法獲得的 Sertoli 細(xì)胞純度最低，而兩步法和三步法分離出的 Sertoli 細(xì)胞純度相當(dāng)，但都高于一步法。因此，較低的細(xì)胞純度可能是一步法分離的Sertoli 細(xì)胞活性下降的原因，而三步法分離出的 Sertoli 細(xì)胞純度雖然也比較高，但是由于細(xì)胞受損傷較嚴(yán)重，活性比較差，而兩步消化法分離出的Sertoli 在活性和純度兩方面均能達(dá)到較高的水平。

不同的Sertoli 細(xì)胞活性和純度導(dǎo)致其與胰島共移植至糖尿病鼠后，產(chǎn)生不同的存活情況。兩步法分離的Sertoli 細(xì)胞活性最好，而且純度也比較高，與胰島共移植術(shù)后能夠快速發(fā)揮其免疫豁免和營養(yǎng)支持作用，胰島移植物的存活時(shí)間最長；三步法分離的Sertoli 細(xì)胞活性較差，與胰島共移植以后不能很好的發(fā)揮免疫豁免作用；一步法分離的Sertoli 細(xì)胞活純度較低，含有一些具有免疫原性的其它細(xì)胞，與胰島共移植以后，其他的細(xì)胞的免疫原性會激活受體的免疫應(yīng)答。所以這兩種方法分離的Sertoli 細(xì)胞與胰島共移植術(shù)后，雖然胰島移植物的的存活時(shí)間較單純的胰島移植有一定程度的延長，但是都明顯短于兩步法分離出來的 Sertoli 細(xì)胞與胰島共移植術(shù)后的胰島移植物的存活時(shí)間。

總之，體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明，采用胰蛋白酶+DNA酶和膠原酶+透明脂酸酶的兩步消化法分離得到的 Sertoli 細(xì)胞活性和純度都較高，這樣的細(xì)胞與胰島共移植至糖尿病鼠模型后，對胰島移植物存活的延長效果更佳。

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