抗酒精化學(xué)損傷的茶氨酸復(fù)合配方篩選與體外抗氧化活性研究

李大偉 張士康 朱躍進(jìn) 施海根

（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016）

抗酒精化學(xué)損傷的茶氨酸復(fù)合配方篩選與體外抗氧化活性研究

李大偉 張士康*朱躍進(jìn) 施海根

（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016）

通過流動注射化學(xué)發(fā)光法篩選以茶氨酸為主要成分的強(qiáng)抗氧化性配方，研制以茶氨酸、γ-氨基丁酸等茶葉特征成分為主要配方的復(fù)合氨基酸顆粒劑（以下簡稱功能修飾因子）。采用不同溶解載體溶解不同濃度的功能修飾因子，通過對·OH、DPPH·、H2O2清除能力和過氧化脂質(zhì)抑制作用的測定，研究功能修飾因子的抗氧化性能。結(jié)果表明，以水、42%乙醇、42%茶酒作為溶解載體溶解的功能修飾因子，均具有較好的抗氧化性能，其中功能修飾因子的42%茶酒溶液在較低濃度就顯示出很好的清除效果，且濃度與清除能力呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，表明茶酒中以兒茶素為主體的茶葉功效成分與功能修飾因子具有較強(qiáng)的協(xié)同增效作用。當(dāng)濃度為4g/mL、1g/mL、2.5g/mL、5g/mL 時(shí)， 對·OH、DPPH·、H2O2、 過氧化脂質(zhì)的清除率最高， 分別為 61.8%、61.92%、51.05%、85.93%。

茶氨酸 茶特征成分 功能修飾因子 抗氧化活性 自由基

隨著生物技術(shù)、營養(yǎng)學(xué)、醫(yī)學(xué)和相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，從天然產(chǎn)物中分離、提純特定功能成分，并探索和驗(yàn)證其生理功能的研究發(fā)展很快，一大批具有明確生理功能的天然產(chǎn)物被廣泛地用于食品行業(yè)，為功能食品、保健品和藥品的開發(fā)和研究提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)和前提。

近年來研究發(fā)現(xiàn)[1,2,3]，以兒茶素、茶氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）為主的茶葉特征成分在對抗酒精所致的自由基損傷方面有突出功效，兒茶素與茶氨酸以及數(shù)種功能氨基酸聯(lián)合使用更可顯著增強(qiáng)抗氧化作用，提示兒茶素與茶氨酸等其它氨基酸具有協(xié)同增效作用。其原因可能是茶多酚（TP）的某些組分與氨基酸之間的氫鍵締合形成穩(wěn)定的供氫體，它不僅提高了TP的抗氧化活性，而且還能與不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物相結(jié)合。

本研究以酒精化學(xué)損傷的自由基理論為基礎(chǔ)，以體外抗氧化性能評價(jià)為指標(biāo)，從眾多功能氨基酸中進(jìn)行廣泛篩選，開發(fā)研制以茶葉中氨基酸為主，其他功能氨基酸為輔的復(fù)合氨基酸顆粒劑（簡稱功能修飾因子），用以延緩及減輕飲酒所帶來的機(jī)體損傷，亦可與各種酒類進(jìn)行復(fù)配，對酒體進(jìn)行功能強(qiáng)化。在配方篩選優(yōu)化基礎(chǔ)上，開展功能修飾因子對·OH、DPPH·、H2O2清除能力和過氧化脂質(zhì)抑制作用的測定。評價(jià)了以不同溶解載體溶解的不同濃度的功能修飾因子溶液的抗氧化能力，為從清除自由基途徑開發(fā)預(yù)防和緩解酒精損傷新產(chǎn)品提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-茶氨酸：自制，純度≥99.8；γ-氨基丁酸(γ-GABA)等功能氨基酸：其中γ-氨基丁酸為自制，純度≥85%，其他氨基酸均為生化試劑，購自上海博奧生物科技有限公司；茶酒：自制，酒精度42%vol、兒茶素含量250mg/100mL；無水乙醇、DPPH·（1,1-二苯基-2-苦肼基自由基）、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、對氨基苯磺酸、鹽酸萘已二胺、亞硝酸鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，均為分析純，杭州華東醫(yī)藥股份有限公司。

IFFM-E型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀：西安瑞邁分析儀器有限公司；UV-2102PC型紫外可見分光光度計(jì)：龍尼柯 （上海）儀器有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；pHS-3C酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHB-111A循環(huán)水式多用真空泵：上海豫康科技儀器設(shè)備有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 功能修飾因子篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]及單因素試驗(yàn)，從眾多功能氨基酸中選取對酒精化學(xué)損傷有保護(hù)作用的6種氨基酸，作為與茶氨酸復(fù)配的配方因子，采用7因素2水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，功能修飾因子篩選實(shí)驗(yàn)正交因素水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)組合L8（27）見表2，通過流動注射化學(xué)發(fā)光法對抗氧化性強(qiáng)的配方組進(jìn)行篩選。

1.2.2 功能修飾因子體外抗氧化活性的篩選

抗氧化活性的測定采用流動注射化學(xué)發(fā)光法[5]。用pH7.4、0.05mol/L的KH2PO4-NaOH緩沖溶液，配制2.0×10-4mol/L的魯米諾溶液及6.0×10-2mol/L的Fe2+-EDTA溶液；并用去離子水配制濃度30%的雙氧水溶液。吸取0.2mLFe2+-EDTA溶液與魯米諾溶液，置25mL容量瓶中，用該緩沖溶液定容至刻度，混勻后作為載流流動相；同時(shí)將配制好的雙氧水注入進(jìn)樣環(huán)，按運(yùn)行程序進(jìn)行流動注射化學(xué)發(fā)光分析，以600V，50Hz，擴(kuò)增1倍信號值條件，進(jìn)行20次/s自動歸零數(shù)據(jù)采集。

按表1～2組方進(jìn)行等濃度配比，精密稱取各樣品0.1g（精確到0.0001g），用去離子水定容至100mL，分別加入配制好的樣品于流動相中，進(jìn)行發(fā)光分析，并以如下公式計(jì)算發(fā)光抑制率(%)：

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表（mg/mL）Table1 The orthogonal factors level（mg/mL）

表2 功能修飾因子篩選正交實(shí)驗(yàn)組合L8（27）（mg/mL）Table2 The results of orthogonal experimentsL8（27）of the Function modifier（mg/mL）

其中Fa為未加抗氧化物質(zhì)的發(fā)光強(qiáng)度，F(xiàn)b為加入抗氧化物質(zhì)后的發(fā)光強(qiáng)度。

1.2.3 功能修飾因子配方對·OH清除率的測定[6]

采用Fenton反應(yīng)法產(chǎn)生·OH，·OH可氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510nm處有強(qiáng)吸收峰。當(dāng)加入清除·OH的物質(zhì)時(shí)，則會與水楊酸競爭·OH，減少有色物質(zhì)生成，降低吸光度。實(shí)驗(yàn)操作如下：取若干支25mL的試管，按順序加入9mmol/L FeSO4溶液 1mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液2mL，不同質(zhì)量濃度的功能修飾因子溶液2mL，8.8mmol/L H2O2溶液 2mL， 于 37℃下反應(yīng)0.5h。以蒸餾水為空白，在510nm處測定樣品的吸光度A1，按下式計(jì)算其清除率：

清除率(%)=[A0－（A1－A2）]/A0×100%

式中：A0為空白對照液的吸光度，以蒸餾水代替樣品液的吸光度；A1為樣品液的吸光度；A2為樣品溶液本身的吸光度，以蒸餾水代替顯色劑的吸光度。

1.2.4 功能修飾因子配方對DPPH·清除率測定[7]

DPPH·（1,1-二苯基-2-苦肼基自由基)是一種穩(wěn)定的人工合成的自由基，具有典型紫色，在517nm處有最大吸收，當(dāng)它與提供1個(gè)電子的自由基清除劑作用時(shí)，生成無色產(chǎn)物，紫色變淺。實(shí)驗(yàn)操作如下：取5×10-5mol/L的DPPH·溶液4mL，加入不同質(zhì)量濃度的功能修飾因子0.20mL，搖勻后放置30min，測定517nm處的吸光度A1，按下式計(jì)算其清除率：

清除率(%)=[A0－（A1－A2）]/A0×100%

式中：A0為DPPH·溶液的吸光值；A1為樣品組與DPPH·溶液混合后的吸光值；A2為樣品組的吸光值。

1.2.5 功能修飾因子配方清除H2O2能力的測定[8]

用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制10mmol/L的H2O2溶液，取上述溶液5mL加入等體積不同質(zhì)量濃度的功能修飾因子，混勻后在248nm處測定吸光度，按下式計(jì)算清除率：

清除率(%)=[A0－（A1－A2）]/A0×100%

式中：A0為不加樣品液的H2O2吸光度，A1為加樣品液的H2O2吸光度，A2為不加H2O2的樣品溶液吸光度。

1.2.6 脂質(zhì)過氧化抑制作用的測定

(1)卵磷脂體系試液的配制

卵磷脂溶液(LLS)：30mg卵磷脂溶解于30mL 10mmol/L pH7.4 PBS(磷酸緩沖液)，冰浴震蕩。

TCA-TBA-HCl混合液：三氯醋酸(TCA)∶硫代巴比妥酸(TBA)∶鹽酸=15g∶0.375g∶2.1mL，溶解于蒸餾水，定容至100mL。

(2)測定步驟

于樣品試管中依次加入1.0mL卵磷脂溶液(LLS)、1.0mL 0.1%三氯化鐵溶液 (FeCl3)、1.0mL 4 mmol/L抗壞血酸和0.2mL樣品，混勻，避光，于37℃水浴30min，再加入2.0mL TCA-TBA-HCl混合液，90～100℃水浴15min，迅速冷卻，以2000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液在532nm處測吸光值A(chǔ)，同上做空白對照，以維生素E為對照，每樣品重復(fù)3次。

清除率(%)=[1－(A1－A2)/A0]×100%

式中：A1為加抗氧化劑時(shí)溶液的吸光度，A2為加抗氧化劑而未加TCA-TBA-HCl溶液的吸光度，A0為只加溶劑時(shí)溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能修飾因子篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在1.2.1實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，得出茶氨酸和氨基酸Ⅰ、氨基酸Ⅱ、氨基酸Ⅴ、氨基酸Ⅵ配伍組成的功能修飾因子抗氧化性效果較好，見圖1。

圖1 功能修飾因子自由基清除能力Fig.1 Radical scavenging capacity of the Function modifier

由圖1可以看出，相同濃度下，各配方組對自由基都有了較好的清除效果，顯示各配方組均具備較好的抗氧化性能，自由基清除效果依次為3＞2＞5＞7＞6＞8＞4＞1，清除率依次為：72.06%、70.06%、67.71%、67.72%、67.6%、65.07%、60.06%、58.64%。故選用茶氨酸和氨基酸Ⅰ、氨基酸Ⅱ、氨基酸Ⅴ、氨基酸Ⅵ配伍作為功能修飾因子配方。

2.2 不同溶解載體溶解的不同濃度的功能修飾因子體外抗氧化活性評價(jià)

2.2.1 功能修飾因子對·OH的清除效果

羥自由基是最活潑的活性氧自由基，反應(yīng)速率極快，對機(jī)體危害很大。圖2為不同溶解載體溶解不同濃度的功能修飾因子對·OH的清除效果。

圖2 功能修飾因子對·OH的清除能力Fig.2·OH radical scavenging capacity of the Function modifier

由圖2可知，不同溶解載體溶解的不同濃度的功能修飾因子對·OH有一定的清除效果，其清除率的大小依次為：功能修飾因子42%茶酒溶液＞功能修飾因子42%乙醇溶液＞功能修飾因子水溶液。3種溶液對·OH的清除效果都隨著用量的增加而增加，當(dāng)用量為4g/mL時(shí)，功能修飾因子水溶液、功能修飾因子42%乙醇溶液、功能修飾因子42%茶酒溶液的清除率分別為51.96%、56.99%、61.8%，繼續(xù)增加濃度，清除效果增加不明顯。

2.2.2 功能修飾因子對DPPH·的清除效果

不同溶解載體溶解的不同濃度的功能修飾因子對DPPH·清除效果，如圖3所示。由圖3可以看出，不同溶解載體溶解的不同濃度的功能修飾因子對DPPH·有一定的清除效果，以功能修飾因子42%茶酒溶液效果最好，其次是功能修飾因子42%乙醇溶液、功能修飾因子水溶液。在0～1g/mL濃度范圍內(nèi)，3種提取液對DPPH·的清除效果都隨著濃度增加而增加，當(dāng)濃度為1g/mL時(shí)，功能修飾因子水溶液、功能修飾因子42%乙醇溶液、功能修飾因子42%茶酒溶液的清除率分別為42.68%、58.99%、61.92%，繼續(xù)增加濃度，功能修飾因子42%乙醇溶液清除效果繼續(xù)增加，而功能修飾因子水溶液和功能修飾因子42%茶酒溶液增加不明顯。

圖3 功能修飾因子對DPPH·清除能力Fig.3 DPPH·radical scavenging capacity of the Function modifier

2.2.3 功能修飾因子對H2O2的清除效果

H2O2可以與細(xì)胞內(nèi)的Fe2+離子生成·OH，另外，紫外線也能使H2O2生成羥基自由基，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生，加速機(jī)體衰老，給生物體帶來危害。圖4為不同溶解載體溶解的不同濃度的功能修飾因子對H2O2的清除效果。

圖4 功能修飾因子對H2O2的清除能力Fig.4 H2O2scavenging capacity of the Function modifier

由圖4可知，不同溶解載體溶解的不同濃度的功能修飾因子對H2O2的清除效果分別為：功能修飾因子42%茶酒溶液＞功能修飾因子42%乙醇溶液＞功能修飾因子水溶液。不同溶解載體溶解的不同濃度的功能修飾因子對H2O2的清除效果都隨著濃度的增加而增加，當(dāng)樣品濃度為2.5g/mL時(shí)，功能修飾因子42%茶酒溶液、功能修飾因子42%乙醇溶液、功能修飾因子水溶液對H2O2的清除率分別為51.05%、42.21%、22.66%。

2.2.4 對脂質(zhì)過氧化的抑制作用

脂質(zhì)過氧化是慢性酒精性肝病的病因之一，其終產(chǎn)物MDA可與膜蛋白、酶發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使膜透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能和代謝發(fā)生變化，對人體危害極大，其測定結(jié)果見圖5。

圖5 功能修飾因子對脂質(zhì)過氧化的抑制作用Fig.5 Inhibition effects of the Function modifier on lipid peroxidation

由圖5可見，在0.5g/mL～5g/mL的濃度范圍內(nèi)，不同溶解載體溶解的不同濃度的功能修飾因子均具有一定的抑制脂質(zhì)過氧化的能力，且抑制脂質(zhì)過氧化的能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)。三種溶解載體在高濃度均顯示較好的清除過氧化脂質(zhì)的能力，當(dāng)濃度為5g/mL時(shí)，功能修飾因子水溶液、功能修飾因子42%乙醇溶液、功能修飾因子42%茶酒溶液對過氧化脂質(zhì)的清除率分別為51.25%、72.13%、85.93%。

3 結(jié)論

采用自由基體系、過氧化氫體系、脂質(zhì)過氧化體系研究功能修飾因子的抗氧化活性，結(jié)果表明，水、42%乙醇、42%茶酒溶解的功能修飾因子，均具有較好的抗氧化性能，其中功能修飾因子42%茶酒溶液在較低濃度就顯示出很好的清除效果，且濃度與清除能力呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，表明茶酒中以兒茶素為主體的茶葉功效成分與功能修飾因子具有較強(qiáng)的協(xié)同增效作用。當(dāng)濃度為4、1、2.5、5g/mL 時(shí)，對·OH、DPPH·、H2O2、過氧化脂質(zhì)的清除率最高分別為 61.8%、61.92%、51.05%、85.93%。

在慢性酒精性肝病和其他各種形式的中毒性肝病中，有毒物質(zhì)在肝內(nèi)代謝產(chǎn)生的自由基具有重要的致病作用。過量的自由基可以與細(xì)胞膜脂質(zhì)、脂蛋白共價(jià)結(jié)合，生成過氧化脂質(zhì)等毒性物質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞被破壞。本研究篩選的茶氨酸復(fù)合配方經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)顯示了其優(yōu)良的清除自由基能力，這提示其在治療酒精及其他中毒性肝損傷方面可能具有相當(dāng)?shù)拈_發(fā)潛力，有關(guān)該配方的體內(nèi)作用效果有待進(jìn)一步深入研究。

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Screening of Theanine Complex for Inhibition of Alcohol Chemical Injury and its In Vitro Antioxidant Activity

LI Da-wei,ZHANG Shi-kang*,ZHU Yue-jin,SHI Hai-gen
(Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China)

Flow-injection chemiluminescence was used to determine the antioxidant activity of product mainly composed of theanine.Complex was prepared by theanine and γ-amino butyrate as main antioxidants(Hereinafter referred to as functional modifier).The antioxidant activities,including the ·OH radical,DPPH·radical,H2O2scavenging activities and inhibition of Lipid peroxide,of the complex solutions with differed amount in different solvents were determined.The results showed that water,42%ethanol,42%tea wine as a function of solvent modifier,has better oxidation resistance,in which the function modifier solution in the lower 42% of tea wine shows good concentration on the removal of effect,and the concentration and scavenging obviously showed dose-response relationship,indicating that the catechins in tea and wine as the main effect of composition and function of the tea has a strong modifying factor synergies.When the concentrations were 4 g/mL,1g/mL,2.5g/mL,5g/mL,the·OH,DPPH·,H2O2,lipid peroxidation highest clearance rates were 61.8%,61.92%,51.05%,85.93%.

Theanine,Characteristic antioxidant ingredients in tea,Antioxidant activity,Function modifier,Radical

2011-05-17

部級科技成果：供銷鑒字[2010]第08號

李大偉（1983-），男，吉林長春人，研究實(shí)習(xí)員，主要從事功能性食品的研究開發(fā)工作。

*通訊作者：zsk6510@163.com