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    抗HIV-1活性化合物作用靶點(diǎn)的快速判斷方法

    2011-12-01 04:47:06馬鈴張全殷霄李曉宇趙立勛岑山
    中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2011年5期
    關(guān)鍵詞:逆轉(zhuǎn)錄酶熒光素酶靶點(diǎn)

    馬鈴,張全,殷霄,李曉宇,趙立勛,岑山

    目前,艾滋病的防治工作主要依靠抗 HIV-1 藥物,臨床使用的抗 HIV 藥物主要是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、融合抑制劑和整合酶抑制劑。逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI),如 Zidovudine(AZT)、Lamivudine(3TC)、Emtricitabine(FTC)等,非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI),如 Efavirenz(EFV)、Nevirapine(NVP)、Delavirdine(DLV)等。蛋白酶抑制劑主要有Ritanovir(RTV)、Saquinavir(SQV)、Indinavir(IDV)等。融合抑制劑主要有 Enfuvirtide(T20)。整合酶抑制劑主要有 Elvitegravir(GS- 9137)和Raltegravir(MK-0518)[1-2]。

    盡管目前臨床上抗 HIV-1的藥物已多達(dá) 20 余種,但由于HIV-1 高變異而導(dǎo)致的多重或交叉耐藥性等問題,開發(fā)新作用機(jī)制的抗 HIV-1 藥物仍然是當(dāng)務(wù)之急[3]。在抗HIV-1 活性化合物篩選過程中,對(duì)化合物作用機(jī)制的快速判斷,以及排除藥物篩選過程中的脫靶現(xiàn)象,將減少藥物研發(fā)過程中的盲目性,同時(shí)也能降低研究成本。因此,本研究針對(duì)這一問題,建立了一種對(duì)抗 HIV-1 活性化合物作用靶點(diǎn)的快速判斷方法。

    HIV-1的基因組為約 9 kb的正義RNA,其兩端是長末端重復(fù)序列(long terminal repeats,LTR),含順式調(diào)控序列,控制前病毒的表達(dá),在LTR 有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子并含有負(fù)調(diào)控區(qū)。兩端 LTR 之間表達(dá) gag,pol,env,tat,rev,vpu,vpr,vif和nef 9個(gè)主要蛋白。HIV 侵襲靶細(xì)胞的主要過程為:識(shí)別和黏附、膜融合、逆轉(zhuǎn)錄、整合、修飾和翻譯、裝配和釋放。一般將整合以前歸為早期事件,之后歸為晚期事件[4](圖 1)。

    本研究以熒光素酶作為報(bào)告基因,其活性代表病毒的感染性,并用抗 HIV-1 作用靶點(diǎn)明確的藥物(EFV、3TC、MK-0518、SQV和T20)作為陽性對(duì)照,驗(yàn)證不同藥物對(duì)病毒生活周期的影響,最終確立快速判斷未知化合物抗HIV-1 活性作用靶點(diǎn)的方法,為后續(xù)的篩選及研究工作提供便利。

    1 材料和方法

    1.1 主要材料

    圖1 HIV-1 病毒生活周期

    293T 細(xì)胞(本室保存)培養(yǎng)于含 100 U/ml 青霉素、鏈霉素和10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中;SupT1 細(xì)胞(本室保存)培養(yǎng)于含 100 U/ml 青霉素、鏈霉素和10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中;質(zhì)粒 pNL-Luc-E-和表達(dá)水泡性口膜炎病毒的外殼糖蛋白 pHCMV-G(VSV-G)質(zhì)粒由醫(yī)科院病原所何玉先教授提供;表達(dá) HIV-1的包膜蛋白pHXB2-Env、陽性對(duì)照 EFV、3TC、T20、MK-0518和SQV均由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)惠贈(zèng),其中 T20 溶于磷酸鹽緩沖液(PBS),其他藥物均溶于二甲基亞砜(DMSO);轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000、Trizol DNA 提取試劑盒均購于美國 Invitrogen公司;MJ MiniTMPCR 儀購自美國Bio-Rad公司。

    1.2 方法

    1.2.1 假病毒的制備 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前接種于6 孔板,細(xì)胞濃度為1.5×105/ml,于2ml 培養(yǎng)基中培養(yǎng),24 h 后轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒 pNL-luc-E- 為全長的HIV-1 缺失了 HIV-1-env基因,并在nef 區(qū)插入了一個(gè)熒光素酶基因,用量為每孔300 ng,pHCMV-G(VSV-G)每孔 210 ng(或 pHXB2-Env每孔 300 ng)。轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000,根據(jù)使用說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h 后收上清,分別為VSV-G-HIV和Env-HIV。其中 T20 所用病毒顆粒為Env-HIV,其余藥物為VSVG-HIV,以下操作相同。

    圖2 實(shí)驗(yàn)流程示意圖(A)以及陽性藥物對(duì)病毒早晚期活動(dòng)的影響(B)

    1.2.2 病毒感染性測定 為了快速判斷抗 HIV-1 活性化合物的作用機(jī)制,我們利用轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生假型病毒和假型病毒感染細(xì)胞兩種技術(shù)手段,人為地將病毒的生活周期分為兩個(gè)階段(圖 2A)。假型病毒感染細(xì)胞的過程代表了 HIV-1從吸附到病毒 DNA 整合的過程,即早期階段。當(dāng)在病毒感染的步驟中加入陽性藥物,可以研究藥物對(duì)病毒早期階段的影響。SupT1 細(xì)胞濃度為5×105/ml,加入 1.2.1 中制備的假病毒顆粒,固定 MOI 為1,直接鋪 96 孔板,每孔200 μl(env-HIV 感染性較弱,鋪 24 孔板,每孔 1ml),每孔加入 2 μl 藥物,設(shè)空白和DMSO 對(duì)照(其中 T20 為PBS 對(duì)照),48 h 后檢測熒光素酶活性。取 50 μl 細(xì)胞懸液,加入裂解液 50 μl,37 ℃ 孵育 0.5 h 后,取其中 5 μl 細(xì)胞裂解液加 40 μl 熒光素酶底物,在熒光檢測器上測定熒光素酶的活性。

    轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生假型病毒的過程包含了從病毒蛋白的表達(dá)到病毒成熟的各個(gè)環(huán)節(jié),為病毒生活周期的晚期階段。對(duì)藥物晚期活性的測定,選在轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞產(chǎn)生假病毒后6 h 加入陽性藥物,濃度為近似的IC90,48 h 后收假病毒感染 SupT1 細(xì)胞。測定陽性藥物對(duì)病毒復(fù)制周期的影響,分別取 0、0.5、1、2、4、6、7、21 h 作為加藥時(shí)間點(diǎn),并在感染病毒后,將細(xì)胞在4 ℃ 放置1 h。離心收集細(xì)胞,將沉淀用 PBS 洗 2 遍,以去掉沒有吸附在細(xì)胞上的病毒,確保病毒在同一時(shí)間進(jìn)入生活周期。

    1.2.3 病毒 DNA的PCR 檢測 由于目前的藥物研發(fā)靶點(diǎn)多集中在早期,如進(jìn)入、逆轉(zhuǎn)錄、整合等時(shí)期,如果能快速判斷活性化合物的作用靶點(diǎn),對(duì)藥物研發(fā)具有指導(dǎo)意義。病毒從進(jìn)入到整合的過程具有時(shí)相性。通過藥物在不同階段對(duì)病毒復(fù)制產(chǎn)生的影響,就可以判斷藥物的作用靶點(diǎn)。病毒生活周期早期大致包括:從結(jié)合在基因組RNA的PBS(primer binding site)的tRNALys3 開始形成–sssDNA(minus strand strong-stop cDNA),–sssDNA的鏈轉(zhuǎn)移,+sssDNA的合成起始,+sssDNA的鏈轉(zhuǎn)移,完整雙鏈 DNA的合成,形成前病毒 DNA,最終整合到宿主細(xì)胞基因組上[4]。本研究利用 PCR 技術(shù)研究病毒感染早期病毒 DNA的復(fù)制狀態(tài),以確定感染早期病毒 DNA 隨時(shí)間的變化情況,進(jìn)而證明病毒復(fù)制過程的時(shí)相性。根據(jù)需要設(shè)計(jì)了U5-R、U5-gag和Alu-U5 三對(duì)引物,分別說明病毒進(jìn)入細(xì)胞后逆轉(zhuǎn)錄的起始、完成以及整合的完成。

    確保病毒在同一時(shí)間進(jìn)入細(xì)胞后,SupT1 細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基稀釋至濃度為5×105/ml,分別在0、0.5、1、2、4、6、7、21 h 這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)(與加藥的時(shí)間點(diǎn)一致)收集細(xì)胞,提取總 DNA,用 PCR 擴(kuò)增病毒 U5-R、U5-gag和Alu-U5,根據(jù)結(jié)果可相應(yīng)判斷出HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄是否起始、完成,整合是否完成。用 GAPDH 作內(nèi)參對(duì)照。引物分別為:U5-R 上游:TCTGGCTAACTAGGGAACCCA;U5-R 下游:CTGACTAAAAGGGTCTGAGG;U5-gag 上游:TGTGT GCCCGTCTGTTGTGTGA;U5-gag 下游:TCAGCAAGCCG AGTCCTGCGT;Alu-LTR 上游:TCCCAGCTACTCGGGAG GCTGAGG;Alu-LTR 下游:AGGCAAGCTTTATTGAGGC TTAAGC;IN 上游:CACACACAAGGCTACTTCCCT;IN下游:TAGCCACTCCCCAGTCCCGCCC[4-5]。

    2 結(jié)果

    2.1 陽性藥物最佳工作濃度的確定

    為了驗(yàn)證上述方法測定的藥物活性與常規(guī)方法結(jié)果是否具有一致性,即陽性藥物的工作濃度是否與文獻(xiàn)報(bào)道一致,我們測定了上述幾種陽性藥物的劑效關(guān)系,并利用Origin 軟件作圖,計(jì)算出陽性藥物的IC50。如表1 所示,所測定的藥物抗病毒活性與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。在隨后的實(shí)驗(yàn)中,我們參考陽性藥物的IC90值,確定了各陽性藥物的工作濃度分別為:T20,15.00 nmol/L;EFV,1.50 nmol/L;3TC,0.50 μmol/L;MK-0518,15.00 nmol/L;SQV,3.00 nmol/L。

    2.2 藥物早晚期活性的確定

    根據(jù)病毒感染性的測定方法,通過測定感染細(xì)胞中熒光素酶活性,定量研究藥物對(duì)病毒感染性的影響,判斷藥物在病毒各生活周期中的活性。為了驗(yàn)證該方案的可行性,我們選擇了作用機(jī)制明確的抗 HIV-1 藥物 T20、EFV、3TC、MK-0518和SQV 進(jìn)行測試。結(jié)果顯示作用于病毒生活周期早期的藥物為T20、EFV、3TC和MK-0518,作用于晚期的藥物為SQV(圖 2),完全符合藥物已知的作用機(jī)制。

    表1 Origin 軟件計(jì)算的各陽性藥物 IC50值與文獻(xiàn)報(bào)道值的比較

    圖3 感染 HIV-1 病毒的SupT1 細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的HIV-1 cDNA PCR 分析

    2.3 病毒生活周期早期的界定

    從病毒 DNA的PCR 檢測結(jié)果可以看出,病毒在進(jìn)入細(xì)胞 1 h 左右逆轉(zhuǎn)錄開始,到第 4 小時(shí)左右完成雙鏈DNA的合成,第 6個(gè)小時(shí)左右整合起始,到第 21個(gè)小時(shí)達(dá)到整合最大值(圖 3)。

    2.4 快速判斷方法的建立

    根據(jù)測定靶點(diǎn)明確的藥物對(duì)病毒復(fù)制不同時(shí)期的影響可以看出,T20 作為融合抑制劑只在病毒進(jìn)入細(xì)胞之前起作用,而在之后的各個(gè)時(shí)期及生活周期晚期均不起作用;EFV 非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑主要在病毒感染后2 h 起作用,之后作用下降直到消失;3TC 核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑主要在感染后1 h 起作用,之后作用下降直到消失;MK-0518 整合酶抑制劑主要在感染后7 h 起作用,之后作用下降,21 h 作用完全消失;而 SQV 在病毒復(fù)制早期幾乎不起作用;與各個(gè)時(shí)期 DNA 狀態(tài)基本一致(圖 4)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們可以通過在不同時(shí)間點(diǎn)加入待檢測的藥物,根據(jù)藥物抗病毒活性的時(shí)相性,快速判斷藥物的作用位點(diǎn)。

    圖4 T20、EFV、3TC、MK-0518和SQV 對(duì)病毒感染性的影響

    3 討論

    目前,艾滋病治療工作主要依靠于抗 HIV-1 藥物。在對(duì)抗 HIV-1 活性化合物篩選時(shí)多采用定靶篩選,其缺點(diǎn)在于篩選過程中可能出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象,并影響對(duì)化合物作用機(jī)制的判斷,為后續(xù)的研究帶來不便。因此,如果能快速判斷活性化合物的作用靶點(diǎn),對(duì)藥物的研發(fā)具有指導(dǎo)意義。

    本方法選擇 T20、EFV、3TC、MK-0518和SQV作為陽性藥物,鑒于細(xì)胞系、質(zhì)粒、藥物來源等客觀條件的不同,以及人為、機(jī)器及軟件分析等方面的誤差,此系統(tǒng)中得出的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道有些許不同,但基本一致,表明此方法與常規(guī)方法具有可比性,可用作抗 HIV-1 活性化合物的篩選。與其他方法(如測 p24 抗原)相比較,具有簡單、微量、費(fèi)用低廉、安全、不受 BSL-3 實(shí)驗(yàn)室限制及不用同位素等特點(diǎn)。此外,如果發(fā)現(xiàn)針對(duì)新靶點(diǎn)的有效藥物,也可同理加入到此方法中,使之更加系統(tǒng)化。本研究為實(shí)驗(yàn)室抗 HIV-1藥物篩選模型的建立提供借鑒與指導(dǎo),具有較強(qiáng)的實(shí)踐意義。

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