重組人干擾素α2b噴霧劑的抗病毒藥效評(píng)價(jià)及臨床觀察

曹琳，張磊，田莉，鄧杰

重組人干擾素 α2b是一種廣譜的抗病毒藥物，對(duì)乙型肝炎、單純皰疹、帶狀皰疹、尖銳濕疣、皰疹性口炎、流感病毒等均有抑制作用，但是臨床上常規(guī)使用的干擾素劑型多為肌肉或靜脈注射給藥，對(duì)病毒造成的局部皮膚或黏膜感染體內(nèi)半衰期短，難以在病變部位達(dá)到有效劑量，而加大給藥劑量又會(huì)增大干擾素對(duì)機(jī)體的毒副作用，限制了其臨床廣泛應(yīng)用。因此，將干擾素開發(fā)成外用經(jīng)皮給藥劑型對(duì)皮膚病毒性感染疾病治療具有現(xiàn)實(shí)意義[1-2]。本文針對(duì)擬定適應(yīng)證利用細(xì)胞病變抑制法（CPE）設(shè)計(jì)了體外抗單純皰疹病毒 I 型及II 型、流感病毒甲型及乙型以及SARS 冠狀病毒藥物有效性試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究重組人干擾素 α2b 噴霧劑（rIFN α2b）對(duì)相關(guān)病毒的體外抗病毒作用，為進(jìn)一步開展臨床研究提供依據(jù)，并開展了臨床治療單純皰疹和尖銳濕疣驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 受試藥物 重組人干擾素 α2b 噴霧劑，20ml/支，rIFN α2b 含量為10萬 IU/ml；對(duì)照品為空白基質(zhì)，包裝與受試藥物相同，均由天津華立達(dá)生物工程有限公司提供，2～10 ℃ 保存。陽性對(duì)照藥物酞丁安搽劑（噴霧型）0.5%（W/V）×10ml，生產(chǎn)廠家為北京四環(huán)制藥廠，分裝于外形與受試藥物相同的瓶內(nèi)，遮光、密閉在陰涼處保存。人標(biāo)準(zhǔn)干擾素 α 2.4萬 IU/ml，購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 病毒株 單純皰疹病毒 I 型 Sm44 株（HSV-1）購自中國藥品生物制品檢定所；單純皰疹病毒 II 型 333 株（HSV-2）、流感甲型病毒90-15、流感乙型病毒 95-184 均由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所惠贈(zèng)；SARS 冠狀病毒北京一號(hào)（BJ-01）由北京華大基因研究中心試驗(yàn)室保存。

1.1.3 細(xì)胞株 非洲綠猴腎傳代細(xì)胞（Vero）來源于美國模式菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所保存；人胚腎原代細(xì)胞（HEK）按常規(guī)制備，細(xì)胞長成單層后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.4 培養(yǎng)基 Eagle’s MEM 為美國 Gibco公司產(chǎn)品；DMEM 為美國 Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國 Gibco公司產(chǎn)品。

1.1.5 試劑 青霉素、鏈霉素和卡那霉素為華北制藥廠產(chǎn)品；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、非放射性細(xì)胞增殖檢測試劑盒（MTS）、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）為美國 Promega公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽（MTT）為美國 Sigma公司產(chǎn)品；L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉、十二烷基磺酸鈉（SDS）為北京化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液及試劑配制 DMEM 培養(yǎng)液含 10% 新生胎牛血清、3% L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素各 100μg/ml、7.5% 碳酸氫鈉、10 mmol/L Hepes；MTS/PMS 染色液按 Promega公司的操作指南配制。

1.2.2 受試藥物對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn) 受試藥物以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋或溶解到特定濃度，倍比稀釋藥物，共 8個(gè)稀釋度。將藥物加到含目標(biāo)細(xì)胞并已培養(yǎng)24 h的96 孔板，每孔培養(yǎng)液 100 μl，空白基質(zhì)同樣處理，另設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。37 ℃ 下 5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞 48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。加 MTS/PMS，每孔 20 μl，37 ℃ 下 5% CO2培養(yǎng) 3 h，加50 μl 10% SDS 檢測 490 nm 下的OD 值作為細(xì)胞健康狀況指標(biāo)，以樣品讀數(shù)不小于正常細(xì)胞對(duì)照的90% 作為無毒性指標(biāo)，計(jì)算引起 50% 細(xì)胞形態(tài)的藥物毒性濃度（TD50）或致半數(shù)細(xì)胞毒性所需濃度(CC50)。

1.2.3 受試藥物對(duì)病毒細(xì)胞病變（CPE）的抑制試驗(yàn) 將（2～3）×105個(gè)細(xì)胞/ml 接種96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔 100 μl，37 ℃ 下 5% CO2培養(yǎng) 24 h，細(xì)胞長成單層，棄培養(yǎng)液，加入一系列無細(xì)胞毒性的2 倍稀釋的受試藥物，每孔 100 μl，37 ℃ 下5% CO2培養(yǎng) 24～96 h，棄培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液洗一次，再用一定稀釋度病毒感染已預(yù)先用受試藥物處理 24 h的細(xì)胞，37 ℃ 吸附 1 h，棄病毒液，加維持液繼續(xù)培養(yǎng)。期間，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，待病毒對(duì)照出現(xiàn) 4個(gè)加號(hào)病變時(shí)（約感染后30 h 左右），以 MTS 法檢測細(xì)胞健康狀況。試驗(yàn)時(shí)設(shè)藥物毒性對(duì)照、空白基質(zhì)對(duì)照、正常細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照、人標(biāo)準(zhǔn) IFNα 陽性對(duì)照及病毒毒力滴定。CPE 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：無細(xì)胞病變?yōu)?，25% 以內(nèi)病變?yōu)?，25%～50% 為2，50%～75% 為3，＞75%為4?？瞻谆|(zhì)對(duì)照同樣處理，設(shè)病毒感染對(duì)照及正常細(xì)胞對(duì)照。計(jì)算抑制 50% 病毒細(xì)胞病變的最小有效濃度（IC50），治療指數(shù)（TI=TD50/IC50）。

1.2.4 臨床試驗(yàn) 采用多中心、隨機(jī)、雙盲對(duì)照臨床試驗(yàn)，患者按照隨機(jī)號(hào)進(jìn)入試驗(yàn)。

1.2.4.1 I 型和II 型單純皰疹治療 治療前記錄水皰發(fā)生的部位、皮損面積、數(shù)目?；颊咦孕袑⑹茉囁幬锘蚩瞻谆|(zhì)對(duì)照藥物外用噴于患處，每天3 次，療程 7 d。療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：痂全部脫落，且無炎癥反應(yīng)，主觀癥狀消失為治愈；全部結(jié)痂，主觀癥狀消失為顯效；部分結(jié)痂，主觀癥狀有好轉(zhuǎn)為進(jìn)步；皮損改變不明顯，或有新發(fā)皮疹為無效。

1.2.4.2 尖銳濕疣治療 治療前記錄疣體發(fā)生的部位、數(shù)目、疣體的外形（包括乳頭狀、雞冠、菜花、扁平疣狀、小丘疹）和靶疣體大小等?；颊呙?周復(fù)診1 次。患者自行將受試藥物或空白基質(zhì)對(duì)照藥物外用噴于患處，每天 4 次，療程 6周。療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：疣體完全消退為痊愈；疣體數(shù)目或面積減少 60% 以上為顯效；疣體數(shù)目或面積減少20%～60% 為進(jìn)步；疣體數(shù)目或面積減少＜20%或繼續(xù)加重為無效；4周無效者，若患者要求退出則按無效處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

臨床試驗(yàn)全部結(jié)束后，匯總病例記錄表，分試驗(yàn)組及對(duì)照組分別統(tǒng)計(jì)比較，所有數(shù)據(jù)經(jīng) SAS 統(tǒng)計(jì)軟件包處理。資料采用卡方檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)?？傆行?[（顯效例數(shù) + 治愈例數(shù)）/全部病例數(shù)]×100%。

2 結(jié)果

2.1 重組人干擾素 α2b 噴霧劑抑制單純皰疹病毒 I 型及II 型對(duì) Vero 細(xì)胞的CPE 作用

在所使用的藥品濃度范圍，rIFN α2b和空白基質(zhì)對(duì) Vero 細(xì)胞無毒性。顯微鏡下觀察未見 rIFN α2b和空白基質(zhì)對(duì) Vero 細(xì)胞形態(tài)有可辨別的影響。rIFN α2b 噴霧劑的半數(shù)有毒濃度 TD50(CC50) ＞10000 IU/ml。

表1 重組人干擾素 α2b 噴霧劑抑制 HSV-1及HSV-2 CPE 試驗(yàn)結(jié)果Table1 The CPE assays of rIFN α2b spray on HSV-1 and HSV-1 attacking Vero cells

表2 重組人干擾素 α2b 噴霧劑抑制流感病毒 CPE 試驗(yàn)結(jié)果Table2 The CPE assays of rIFN α2b spray on influenza virus type I and type II attacking HEK cells

CPE 試驗(yàn)表明 rIFN α2b 抑制 HSV-1 感染Vero 細(xì)胞的IC50為81.2 IU/ml，TI ＞1231；抑制HSV-2的IC50為390.0 IU/ml，TI ＞256（表1）。空白基質(zhì)對(duì) HSV-2 CPE無抑制作用。

2.2 重組人干擾素 α2b 噴霧劑抑制流感病毒甲型及乙型對(duì) HEK 細(xì)胞的CPE 作用

rIFN α2b組三批實(shí)驗(yàn)的TD50均為29.1萬IU/ml，空白基質(zhì)對(duì)照對(duì)細(xì)胞的毒性稀釋度與噴霧劑相同。

CPE 試驗(yàn)表明 rIFN α2b 抑制流感病毒甲型感染 HEK 細(xì)胞病變的平均 IC50為534.1 IU/ml，治療指數(shù) TI ≥ 544.8；抑制流感病毒乙型感染HEK 細(xì)胞病變的平均 IC50為3645.5 IU/ml，治療指數(shù) TI ≥ 79.8（表 2）?？瞻谆|(zhì)各稀釋度均無抑制流感病毒甲型及乙型 CPE的作用。

2.3 重組人干擾素 α2b 噴霧劑抑制 SARS 冠狀病毒對(duì) Vero 細(xì)胞的CPE 作用

在所使用的藥品濃度范圍，rIFN α2b和空白基質(zhì)對(duì) Vero 細(xì)胞無毒性。顯微鏡下觀察未見 rIFN α2b和空白基質(zhì)對(duì) Vero 細(xì)胞形態(tài)有可辨別的影響。rIFN α2b 噴霧劑的半數(shù)有毒濃度 TD50(CC50) ＞10000 IU/ml。

CPE 試驗(yàn)表明 rIFN α2b 抑制 SARS 冠狀病毒感染 Vero 細(xì)胞病變的平均 IC50為11.77 IU/ml，其治療指數(shù) TI ＞849.6。形態(tài)觀察顯示，rIFN α2b噴霧劑對(duì) SARS 病毒對(duì) Vero 細(xì)胞的攻擊有顯著的抑制作用。空白基質(zhì)對(duì) SARS 冠狀病毒 CPE 無抑制作用。

rIFN α2b 噴霧劑對(duì) SARS 病毒感染的Vero細(xì)胞抑制作用依賴于rIFN α2b的濃度。根據(jù)濃度曲線（圖 1），用 Prizm 軟件分析得 IC50值為11.77 IU/ml。

圖1 重組人干擾素 α2b 噴霧劑抑制 SARS 冠狀病毒CPE 試驗(yàn)結(jié)果Figure1 The CPE assay of rIFN α2b spray on SARS coronary virus attacking Vero cells

2.4 重組人干擾素 α2b 噴霧劑治療 I 型和II型單純皰疹臨床實(shí)驗(yàn)

單純皰疹臨床試驗(yàn)共計(jì)入選 221 例，完成的合格病例217 例（試驗(yàn)藥物組110 例，空白基質(zhì)對(duì)照組107 例），因各種原因退出4 例（試驗(yàn)藥物組失訪 2 例，對(duì)照組失訪 2 例），入選時(shí)兩組患者的年齡、性別及皮損嚴(yán)重程度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。

試驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，兩組間的開始結(jié)痂時(shí)間、全部結(jié)痂時(shí)間、開始脫痂時(shí)間及全部脫痂時(shí)間，在治療第 2、3、5、7、10 天的治愈率、顯效率、有效率試驗(yàn)組均高于對(duì)照組；兩組間總體療效試驗(yàn)組均高于對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05（表 3）。治療結(jié)束后，醫(yī)生對(duì)療效的主觀評(píng)價(jià)為“好”和“良好”的比例：試驗(yàn)組89.09%（98/110），空白基質(zhì)對(duì)照組59.81%（64/107），經(jīng)卡方檢驗(yàn) χ2=24.57，P＜0.001，兩組有顯著性差異。

試驗(yàn)組出現(xiàn)局部皮膚干燥 2 例；對(duì)照組出現(xiàn)輕度瘙癢 1 例，輕度刺痛 1 例，不良反應(yīng)發(fā)生率為試驗(yàn)組1.81%（2/110），對(duì)照組1.87%（2/107）。

表3 重組人干擾素 α2b 噴霧劑和空白基質(zhì)治療單純皰疹療效對(duì)比Table3 The treatment effect of rIFN α2b spray on herpes simplex

表4 重組干擾素 α2b 噴霧劑與酞丁安搽劑治療尖銳濕疣對(duì)比Table4 The treatment effect of rIFN α2b spray on condyloma acuminatum

2.5 重組人干擾素 α2b 噴霧劑治療尖銳濕疣臨床實(shí)驗(yàn)

受試藥物實(shí)驗(yàn)組和酞丁安搽劑對(duì)照組治療尖銳濕疣共入選病例125 例。干擾素噴霧劑治療組61 例，其中中途退出2 例（失訪），可評(píng)價(jià)療效與安全性 59 例。酞丁安搽劑組64 例，其中中途退出3 例（失訪），可評(píng)價(jià)療效與安全性 61 例。兩組間年齡、性別、病程及治療前兩組間平均疣體數(shù)目、平均疣體面積、疣體形態(tài)等經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均無顯著性差異（P ＞0.05）。

經(jīng)過兩種藥物治療 4～6周后，均有患者的疣體消退。試驗(yàn)第 6周時(shí)，通過計(jì)算對(duì)比每一患者治療前后疣體數(shù)目和面積的改變，分別統(tǒng)計(jì)出兩組的治愈率及總有效率。干擾素噴霧劑組治愈率為17.0%（10/59）、總有效率為22.0%（13/59）；酞丁安搽劑組治愈率為14.8%（9/61）、總有效率為22.9%（14/61），經(jīng)卡方檢驗(yàn)分別為χ2=10和χ2=0.014，P ＞0.5，兩組無顯著性差異（表 4）。

6周的療程中，兩組患者均未發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)不良反應(yīng)。兩組共有 10 例患者在治療過程中出現(xiàn)局部不良反應(yīng)，不良反應(yīng)發(fā)生率為試驗(yàn)組6.8%（4/59），對(duì)照組9.8%（6/61），主要表現(xiàn)為局部刺激反應(yīng)如輕度紅腫、灼痛和瘙癢等，表現(xiàn)輕微可自行緩解。

3 討論

體外實(shí)驗(yàn)表明重組人干擾素 α2b 噴霧劑對(duì) I型和II 型單純皰疹病毒、甲型和乙型流感病毒、SARS 冠狀病毒有顯著抑制作用。臨床研究表明重組人干擾素 α2b 噴霧劑對(duì) I型和II 型單純皰疹病毒感染具有很好的治療效果，推薦使用方法3 次/天，外用于皮損局部。重組人干擾素 α2b 噴霧劑對(duì)尖銳濕疣有一定的療效，可用于輔助治療。

重組人干擾素 α2b 噴霧劑是蛋白質(zhì)經(jīng)皮給藥技術(shù)的創(chuàng)新性嘗試，解決了干擾素液體穩(wěn)定性的技術(shù)瓶頸，采用非接觸，定量經(jīng)皮給藥方式，使用安全、衛(wèi)生、方便，無明顯不良反應(yīng)，相對(duì)于常規(guī)的注射給藥方式有其獨(dú)特的優(yōu)越性。本研究也為干擾素經(jīng)皮給藥治療帶狀皰疹、口腔潰瘍、皰疹性口炎以及流行性感冒等多種疾病的研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]Zhang L, Liu R.Research progress in drug delivery for interferon.China Prescription Drug, 2003, 15(6):50-51.(in Chinese)張磊, 劉睿.干擾素給藥研究.中國處方藥, 2003, 15(6):50-51.

[2]Zhang L, Deng J, Tian L, et al.Study on stable interferon liquid formulation.Pharm Biotechnology, 2005, 12(5):383-388.(in Chinese)張磊, 鄧杰, 田莉,等.液體穩(wěn)定干擾素及其相關(guān)研究.藥物生物技術(shù), 2005, 12(5):383-388.