茶葉、茶鮮葉及茶湯中啶蟲脒殘留的檢測(cè)*

蘇婷，侯如燕，趙秀霞，錢曉三，楊婷婷

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，教育部、農(nóng)業(yè)部茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥，230036)

茶葉、茶鮮葉及茶湯中啶蟲脒殘留的檢測(cè)*

蘇婷，侯如燕，趙秀霞，錢曉三，楊婷婷

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，教育部、農(nóng)業(yè)部茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥，230036)

建立了茶葉、茶鮮葉、茶湯中的啶蟲脒殘留量的液相色譜檢測(cè)方法。茶葉樣品經(jīng)乙腈提取，堿性NaCl飽和溶液萃取，Envi-Carb/NH2固相萃取柱凈化，10 mL乙腈洗脫，液相色譜-紫外檢測(cè)器檢測(cè)，茶葉，茶鮮葉啶蟲脒的添加濃度為0.1～1.0mg/kg時(shí)，其平均回收率為68.5% ～103.6.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤13.6%。茶湯啶蟲脒的添加濃度為0.033～0.333 mg/L時(shí)，其平均回收率為:73% ～103.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤7.6%。用該方法最低檢出濃度為分別為:0.07、0.09 mg/kg、0.002 mg/L，符合農(nóng)藥殘留分析要求。該方法可用于茶葉中啶蟲脒的常規(guī)檢測(cè)和啶蟲脒在茶葉生產(chǎn)中應(yīng)用的安全性評(píng)價(jià)研究。

啶蟲脒，農(nóng)藥殘留，高效液相色譜，固相萃取，茶葉

啶蟲脒，通用名acetamiprid，是繼吡蟲啉之后又一種新煙堿類優(yōu)良?xì)⑾x劑，具有廣譜、內(nèi)吸、速效、低毒、活性高、用量少、持效期長(zhǎng)等特性［1－3］。由于其作用機(jī)理與現(xiàn)有農(nóng)藥不同，對(duì)有機(jī)磷、氨基甲酸酯以及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥產(chǎn)生較強(qiáng)抗性的害蟲亦有效，能有效防治半翅目和鱗翅目等害蟲［4］。3%啶蟲脒乳油防治茶小綠葉蟬擊倒力強(qiáng)、效果顯著［5］。2007年歐盟新公布的茶葉農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn)中就新增了啶蟲脒殘留的限量為 0.1 mg/kg［6－7］，我國(guó)尚未制定啶蟲脒的MRLs標(biāo)準(zhǔn)。茶葉基質(zhì)非常復(fù)雜，含有大量酚類及生物堿化合物，嚴(yán)重干擾農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。樓正云［3］、盧聲宇［6］等報(bào)道了啶蟲脒的氣相色譜檢測(cè)方法。但由于啶蟲脒農(nóng)藥極性大，在氣相進(jìn)樣口易吸附，因此預(yù)試驗(yàn)中表現(xiàn)了重復(fù)性差的特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中食品煙堿類農(nóng)藥殘留多用液相色譜檢測(cè)［8－9］，Monika Gupta［10］等報(bào)道了液相色譜檢測(cè)茶葉中啶蟲脒的檢測(cè)方法，但樣品前處理方法操作繁瑣，使用了二氯甲烷等大量有毒的有機(jī)溶劑。因此，本文旨在建立一種簡(jiǎn)便的茶葉、茶鮮葉及茶湯中啶蟲脒殘留檢測(cè)的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695液相色譜儀:配Waters 2489紫外檢測(cè)器(美國(guó) Waters公司);色譜柱:Phenomenex Gemini C18110A(Φ4.6 mm × 250 mm，5 μm);R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司);IKA ALL basic組織粉碎機(jī)(德國(guó)IKA公司);Vortex-2渦旋儀(美國(guó));KQ-250DE超聲波清洗器(江蘇昆山儀器公司);固相萃取裝置(美國(guó) Agilent);Envi-Carb(500 mg，6 mL)、Envi-Carb/LC-NH2(500 mg/500 mg，6 mL)均購(gòu)自美國(guó)Supelco公司;Hitech-kflow超純水機(jī)(Hitech公司)。

啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%，德國(guó)Dr.Ehrensterfer公司);甲醇、乙腈為色譜純，無(wú)水硫酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉(分析純)，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制

啶蟲脒標(biāo)樣:準(zhǔn)確稱取固體標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg左右，放入小燒杯加乙腈超聲溶解，定容至10 mL，配制500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用時(shí)再根據(jù)不同農(nóng)藥在儀器上的靈敏度稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

凈化用A液(20 mmol/L NaOH-NaCl飽和溶液配制):稱取0.8 g NaOH 和360 g NaCl，加適量水溶解后定容至1 000 mL。

1.2.2 樣品制備

茶葉樣品:取市售茶葉樣品，置固體粉碎機(jī)中搗碎。對(duì)照茶鮮葉樣品采摘自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉試驗(yàn)場(chǎng)(未噴施任何農(nóng)藥)，并取部分茶鮮葉按照傳統(tǒng)綠茶加工方式制成茶葉。陽(yáng)性樣品為噴施啶蟲脒的實(shí)驗(yàn)小區(qū)采摘的茶鮮葉及其制成的茶葉。陽(yáng)性樣品為噴施過(guò)啶蟲脒農(nóng)藥的實(shí)驗(yàn)小區(qū)采摘的茶鮮葉及其制成的茶葉，噴施劑量為(推薦劑量有效成分0.1 g/hm2)推薦采摘間隔期14 d。

1.2.3 樣品的提取與凈化

提取。茶葉、茶鮮葉:稱取茶葉2.0 g，加4 mL水浸泡30 min(茶鮮葉8 g)，加5 g NaCl，再分次加入50 mL乙腈振蕩提取，過(guò)濾，合并濾液，取40 mL濾液，加入40 mLA液，劇烈振搖靜置30 min，萃取分層，取上清液25 mL，旋轉(zhuǎn)蒸干。

凈化。加5 mL乙腈預(yù)淋洗Carb-NH2柱(上端加1 cm無(wú)水Na2SO4)，分次加入少量乙腈，共10 mL溶解上述旋干物，并分次加入Carb-NH2柱，真空抽干，收集全部洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸干。用1mL V(甲醇)∶V(水)=10∶90溶解，待 HPLC檢測(cè)。

茶湯。稱取5 g干茶，加150 mL開水浸泡5 min，過(guò)濾待涼后，取出30 mL，加入15 g NaCl，再加入30 mL乙腈劇烈震蕩，靜置30 min，取上層乙腈層15 mL于圓底燒瓶，旋轉(zhuǎn)蒸干。凈化方法與茶葉處理相同。同收集10 mL洗脫液，濃縮至干，1mL V(甲醇)∶V(水)=10∶90待HPLC檢測(cè)。

1.2.4 液相色譜條件

色譜柱:Phenomenex C18(Φ4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相:甲醇-水梯度洗脫，初始流動(dòng)相:甲醇濃度為10%，5 min后梯度升為20%，10 min后升為20%，30 min后40%。流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫 25℃，進(jìn)樣量5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制備

用液相色譜-PDA檢測(cè)器掃描，得啶蟲脒的最大吸收波長(zhǎng)為254 nm，因此采用254 nm作為HPLC-UV的檢測(cè)波長(zhǎng)，采用外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，以0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL 濃度的啶蟲脒甲醇-水(體積比10∶90)溶液進(jìn)樣，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 Y=28.487 X–0.081 3(見圖 1)，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 9。HPLC-UV對(duì)啶蟲脒的最低檢測(cè)量為0.01 mg/kg。

2.3 提取溶劑的選擇

目前常用的茶葉農(nóng)藥殘留提取溶劑有丙酮、乙酸乙酯和乙腈［6］。分別用這3種試劑作提取溶劑來(lái)試驗(yàn)提取率(分別做3個(gè)平行)，分別取2.0 μg/mL溶解于純水的啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL各具塞量筒中，加20 mL丙酮、乙酸乙酯、乙腈，各加入5gNaCl，振蕩，靜置30 min。分別取有機(jī)相各10 mL于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸干，再用5 mL甲醇定容，HPLC檢測(cè)，計(jì)算3種溶劑的提取回收率分別為:丙酮96.3%，乙酸乙酯95.7%，乙腈98.4%。雖然3種溶劑回收率差異不大，但由于茶葉基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的色素、多酚類、生物堿等干擾基質(zhì)，乙腈因其具有極性強(qiáng)、穿孔透力強(qiáng)、提取效率高、共提物最少的特點(diǎn)。故本研究選用乙腈作為提取溶劑。試驗(yàn)又對(duì)比了茶葉在提取前加水浸泡與不加水的提取率，試驗(yàn)表明，不加水直接提取，對(duì)樣品中啶蟲脒的提取率為加水浸泡再提取為29.1%，因此試驗(yàn)選用加水浸泡的再提取的方式。

圖1 啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 凈化方法選擇

由于茶葉基質(zhì)與其他食品成分基質(zhì)相差很大，多酚類和生物堿含量非常高(占茶葉干重的20%～40%)，而這類物質(zhì)在HPLC-UV紫外檢測(cè)時(shí)均有響應(yīng)，對(duì)茶葉農(nóng)藥殘留HPLC分析造成較大影響，選擇目前茶葉農(nóng)藥殘留分析中常用的Carb柱［6］(填料是石墨炭黑，GCB)，可以除去提取液中的大部分色素，提取液顏色有明顯改善，但是對(duì)于強(qiáng)紫外吸收的干擾去除效果不明顯。用Carb-NH2柱(氨基與石墨炭黑柱串聯(lián))凈化，由于氨基柱對(duì)極性物質(zhì)的吸附作用，可除去部分有紫外吸收的極性物質(zhì)(見圖2)，在啶蟲脒出峰時(shí)間25.4～26.2 min時(shí)Carb-NH2凈化效果較單獨(dú)使用Carb柱好，但在26 min附近仍有影響啶蟲脒檢測(cè)的干擾物出現(xiàn)，因此僅用Carb-NH2固相萃取方法不能完全去除干擾，使得啶蟲脒的檢測(cè)限偏高，不能滿足0.1 mg/kg的歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的要求。作者在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)研制過(guò)程中發(fā)現(xiàn)多酚類在堿性條件下可發(fā)生離子化［11］，因此乙腈提取液用堿性水溶液萃取時(shí)，可除去大部分多酚，因此采用堿性飽和氯化鈉溶液萃取乙腈提取液，除去了大量的多酚，取得了滿意的凈化效果(見圖2)，在后續(xù)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了這一點(diǎn)。

2.5 方法添加回收結(jié)果

茶葉，茶鮮葉按0.1、0.5、1.0 mg/kg進(jìn)行方法的添加回收試驗(yàn)(見表1)，結(jié)果表明，啶蟲脒茶葉中的平均回收率為99.83% ～100.99%，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.43% ～5.8%;在茶鮮葉中的平均回收率為68.46% ～103.61%，RSD為2.9% ～13.6%。茶湯按0.033、0.167、0.333 mg/L茶湯中添加回收試驗(yàn)(見表2)，回收率為72.95% ～103.75%，RSD為3.5% ～7.6%(空白和加標(biāo)樣品圖譜分別見圖3～圖5)。按添加農(nóng)藥的空白樣品檢出啶蟲脒的峰面積大于基線噪聲3倍的量來(lái)估算方法的檢測(cè)限，茶葉、茶鮮葉及茶湯中啶蟲脒的檢測(cè)限分別為:0.07、0.09 mg/kg、0.002 mg/L，均符合殘留量的測(cè)定要求。

圖2 不同凈化方法對(duì)茶葉空白提取液干擾去除效果對(duì)比HPLC色譜圖(254 nm)

表1 啶蟲脒在干茶和鮮茶3個(gè)水平的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(重復(fù)3次)

表2 啶蟲脒在茶湯中3個(gè)水平的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

圖3 空白茶葉和加標(biāo)后樣品的色譜圖

圖4 鮮葉空白與加標(biāo)樣品色譜圖

圖5 茶湯空白與加標(biāo)樣品色譜圖

2.6 實(shí)際樣品分析

取噴藥后第14天采摘制成的茶葉、茶鮮葉以及浸泡所得的茶湯檢測(cè)到啶蟲脒的殘留量水平在0.2～0.3 mg/kg。

3 結(jié)論

建立了茶葉、茶鮮葉和茶湯啶蟲脒殘留檢測(cè)的HPLC方法，樣品經(jīng)乙腈提取，堿性氯化鈉溶液萃取、Carb-NH2柱凈化、乙腈洗脫，較好的去除了復(fù)雜的茶葉基質(zhì)干擾，前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，方法只使用了一種前處理溶劑:乙腈，且方法的準(zhǔn)確度、精密度滿足檢測(cè)農(nóng)殘檢測(cè)要求，并且應(yīng)用此方法檢測(cè)了實(shí)際樣品中啶蟲脒殘留。

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A Method for Determination of Acetamiprid Residue in Tea，F(xiàn)resh Tea and Tea Infusion with HPLC-UV

Su Ting，Hou Ru-yan，Zhao Xiu-xia，Qian Xiao-san，Yang Ting-ting
(College of Tea＆ Food Sicence and Technology，Key Laboratory of Tea Biochemistry＆Biotechnology，Ministry of Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)

An effective method was developed for analysis of acetamiprid residue in tea，fresh tea and tea infusion by high performance liquid chromatography(HPLC)with UV detector．Tea samples were extracted by acetonitrile and Nacl Alkaline saturated solution，then purified with the Envi－Carb/NH2cartridge，finally eluted with 10ml acetonitrile．Imidcloprid recoveries in tea，fresh tea were in the range of 68．5% ～103．6%with 0．1 ～1．0mg/kg acetamiprid and relative standard deviations(RSD)．when acetamiprid content was 0．033 ～0．333mg/L in infusion，The recovery was 73% ～103．8%with RSD less than 7．6%．Practical determination limit in tea，fresh tea and infusion respectively was 0．07mg/kg，0．09mg/kg and 0．002mg/L．the method is quick and effective．It can be used for routine monitoring of the acetamiprid residues and safety assessment research in the tea．

acetamiprid，pesticide residues，HPLC，solid-phase extraction，tea

碩士研究生(侯如燕為通訊作者，E-mail:hry@ahau．edu．cn)。

*農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(農(nóng)科教發(fā)［2008］10號(hào))及張一元科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目資助

2011－04－18，改回日期:2011－10－08