耐藥乳腺癌裸鼠模型免疫治療初探*

龐 華 司玉玲 綦振家 王英娟 王 亮 李世俊

乳腺癌是危害人類生命的惡性腫瘤，特別是多藥耐藥性乳腺癌，其表現(xiàn)為治療效果差、轉(zhuǎn)移率高、死亡率高。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer cells，CIKs）是在白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-1、干擾素（IFN）-γ和抗CD3單克隆抗體等作用下,由單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)而獲得的一種具有細(xì)胞毒作用的免疫活性細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞（DC）是最具潛力的抗原提呈細(xì)胞，在初始免疫和獲得性免疫中起到重要作用。以DC為基礎(chǔ)的免疫治療已經(jīng)成為治療耐藥腫瘤的希望[1]。對于化療無效和多次化療后復(fù)發(fā)的腫瘤患者，其體內(nèi)腫瘤細(xì)胞多存在原發(fā)或繼發(fā)性多藥耐藥（MDR），P-糖蛋白（P-gp）是導(dǎo)致MDR的原因之一，它可以作為腫瘤抗原被識別殺傷[2]。本研究將表達(dá)P-gp的耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR抗原沖擊DC，然后與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其在MCF-7/ADR裸鼠體內(nèi)的影響并比較抑瘤率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 RPMI-1640粉劑購自美國Hyclone公司；新生牛血清購自Hyclone Laboratories Inc公司；淋巴細(xì)胞分離液購自Sigma公司；10%二甲基亞砜（DMSO）、重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重組人白細(xì)胞介素（rhIL）-4和重組人腫瘤壞死因子-α(rhTNF-α)均購自Bioscience公司；rhIL-2、抗人 CD3單抗、重組人干擾素（rhIFN）-γ、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-2酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自晶美生物公司；抗人CD40-FITC、CD80-PE、HLA-DR-APC單抗均購自Burlingame公司；抗人CD3-PE、CD56-APC、CD8-FITC、PGP-FITC和IgG-FITC單抗均購自Immunotech公司。

1.1.2 靶細(xì)胞和裸鼠 MCF-7/ADR細(xì)胞（其P-gp抗原表達(dá)為90%左右）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院；5～6周大小SCID裸鼠購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤裸鼠模型建立 收集對數(shù)生長期的MCF-7/ADR細(xì)胞，生理鹽水洗滌2遍，1 800 r/min離心，計(jì)數(shù)，制成濃度為1×107/mL的細(xì)胞懸液，在每只裸鼠右側(cè)腋下按每只裸鼠接種1 mL進(jìn)行接種，腫瘤體積生長到直徑0.5 cm為成瘤。

1.2.2 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR細(xì)胞凍融抗原的制備 收集對數(shù)生長期的MCF-7/ADR細(xì)胞，生理鹽水洗滌2遍，1 800 r/min離心，計(jì)數(shù)，制成濃度為1×107/mL的細(xì)胞懸液，加入100 μL生理鹽水中，放入液氮中，5 min后，迅速放入37℃水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反復(fù)3次，微孔濾膜過濾，收集濾液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DC體外誘導(dǎo)培養(yǎng) 收集健康人外周血細(xì)胞,通過淋巴細(xì)胞分離液體分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，置于含10%新生牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，在37℃飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)2 h后，收集黏附細(xì)胞，加培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/mL，接種于24孔培養(yǎng)板（1 mL/孔）中，加入終濃度為1 000 U/mL的rhGM-CSF、500 U/mL的rhIL-4，在37℃飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h進(jìn)行半量換液并加入首次濃度1/2量的上述細(xì)胞因子，在培養(yǎng)到第5天時(shí)，部分DC和上述凍融抗原按原細(xì)胞數(shù)1∶5進(jìn)行凍融抗原沖擊（AP-DC），與未沖擊的DC共同于第7天加入TNF-α1 000 U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)到第8天。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，每24 h觀察細(xì)胞形態(tài)變化，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)對DC細(xì)胞進(jìn)行成熟表型流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 CIK細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 收集單個(gè)核細(xì)胞中的非黏附細(xì)胞，并用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞數(shù)為3×106/mL，接種于24孔平底培養(yǎng)板（1 mL/孔），第1天加入1 000 U/mL的rhINF-γ,刺激24 h后，加入抗CD3單抗50 μg/L及300 U/mL的rhIL-2，以后每3 d以含有300 U/mL的rhIL-2的新鮮CIK培養(yǎng)液全量換液。培養(yǎng)到第8天，將CIK細(xì)胞分3組繼續(xù)培養(yǎng)，分別是抗原沖擊的DC與CIK共培養(yǎng)組（AP-DC+CIK組）、DC與CIK共培養(yǎng)組（DC+CIK組）和CIK單獨(dú)培養(yǎng)組（CIK組）。DC與CIK細(xì)胞按照1∶10比例進(jìn)行共培養(yǎng)，到共培養(yǎng)第15天，收集上述各組細(xì)胞進(jìn)行表型及細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2）分泌水平等功能檢測。

1.2.5 細(xì)胞表型測定 分別檢測共育前后的CIK細(xì)胞表型（CD3、CD56、CD8）和AP-DC表型（CD40、CD80、HLA-DR）。將待測細(xì)胞調(diào)節(jié)濃度為1×106/mL，取細(xì)胞懸液100 μL/管，分別加入相應(yīng)單克隆抗體各20 μL，混勻后置室溫下暗室反應(yīng)30 min，加PBS緩沖液，1 000 r/min,5 min離心洗滌后,以1%多聚甲醛固定備做流式檢測。Cell Quest軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 細(xì)胞因子分泌水平的測定 取3組細(xì)胞（AP-DC+CIK、DC+CIK、CIK）上清液用ELISA試劑盒分別進(jìn)行IFN-γ、TNF-α、IL-2分泌水平的測定，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7 細(xì)胞分組經(jīng)尾靜脈注入裸鼠體內(nèi) 以接種MCF-7/ADR的SCID裸鼠腫瘤體積生長到直徑為0.5 cm為成瘤，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分到4組中，分別注射3組中的效應(yīng)細(xì)胞，第4組注射生理鹽水作為對照組（生理鹽水組），從注射開始每7 d測量腫瘤的最大縱徑（a）及最大橫徑（b）1次,腫瘤體積=0.5×a×b2,觀察腫瘤生長的情況。注射治療35 d后，處死荷瘤裸鼠，取出瘤體并稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組瘤質(zhì)量/對照組瘤質(zhì)量）]×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組內(nèi)及組間相同指標(biāo)進(jìn)行配對t檢驗(yàn)或方差分析，方差分析后組間進(jìn)一步比較用Bonferroni法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P-gp在MCF-7/ADR細(xì)胞的表達(dá)情況 流式細(xì)胞儀檢測MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp陽性表達(dá)率為83.8%，見圖1。

2.2 CIK細(xì)胞與DC共孵育前后增殖速率和表型變化

2.2.1 增殖速率變化 CIK細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)第4天開始倍增，細(xì)胞體積開始增大，細(xì)胞核大而圓，部分細(xì)胞聚集成簇；培養(yǎng)第7天之后，大部分細(xì)胞聚集成簇生長，形成肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)，懸浮生長于培養(yǎng)液中，見圖2。與抗原沖擊或未沖擊DC共培養(yǎng)后，AP-DC+CIK組可擴(kuò)增到原來的大約20倍左右，DC+CIK組則為原來的大約16倍左右。

2.2.2 與DC共培養(yǎng)后3組CIK細(xì)胞表型變化 共培養(yǎng)結(jié)束后，3組間CIK細(xì)胞表型比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD3+CD56+細(xì)胞比例在AP-DC+CIK組最高，見表1。

2.3 DC形態(tài)觀察及免疫表型

2.3.1 DC形態(tài)觀察 新分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞呈球形散在分布，表面光滑；加入細(xì)胞因子組合培養(yǎng)48 h后，高倍倒置顯微鏡下可見部分細(xì)胞懸浮并發(fā)生聚集樣增生；培養(yǎng)5 d后，大部分細(xì)胞均已懸浮，聚集樣細(xì)胞群變大并可見明顯的多形性，形狀由開始時(shí)的圓形變成不規(guī)則形，部分細(xì)胞可見有樹突狀突起，見圖3A；培養(yǎng)7 d后細(xì)胞均勻分散呈懸浮狀，進(jìn)一步變形，體積增大，胞漿豐富，具有樹突狀突起的細(xì)胞增多且突起更為明顯，見圖3B。

表1 與DC共培養(yǎng)后3組CIK表型分析（n=10，%，±s）

表1 與DC共培養(yǎng)后3組CIK表型分析（n=10，%，±s）

**P<0.01；各細(xì)胞表型組間兩兩比較均P<0.001

組別CIK組DC+CIK組AP-DC+CIK組F CD3+72.219±4.202 82.114±3.092 96.639±1.490 153.764**CD3+CD8+42.844±2.658 59.430±3.606 74.725±5.279 159.095**CD3+CD56+30.215±1.921 41.487±3.967 66.891±4.133 289.954**

2.3.2 與CIK共培養(yǎng)前后DC表型變化 將AP-DC與DC培養(yǎng)到第8天時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測DC成熟表型，然后將它們與CIK共培養(yǎng)后，再次檢測DC成熟表型，結(jié)果顯示，共培養(yǎng)后的成熟標(biāo)志明顯高于共培養(yǎng)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2。

表2 與CIK共培養(yǎng)前后DC表型分析 （n=10，%，±s）

表2 與CIK共培養(yǎng)前后DC表型分析 （n=10，%，±s）

**P<0.01

組別DC組DC+CIK組t AP-DC組AP-DC+CIK組t CD40+27.511±2.316 37.788±3.615 6.918**42.294±2.828 83.589±1.690 35.46**CD80+31.353±4.029 54.195±3.764 12.431**45.210±4.498 86.033±2.406 24.221**HLA-DR+30.681±3.889 53.375±3.395 13.207**53.956±2.283 92.939±4.787 21.046**

2.4 細(xì)胞因子分泌水平測定 收集第15天CIK組、DC+CIK組和AP-DC+CIK組上清液，測定IFN-γ、TNF-α、IL-2分泌水平，AP-DC+CIK 組 IFN-γ是DC+CIK組、CIK組的約2倍、7倍，AP-DC+CIK組TNF-α是DC+CIK組、CIK組的約2倍、7倍，AP-DC+CIK組IL-2是DC+CIK組、CIK組的約2倍、3倍。

2.5 荷瘤裸鼠治療前后腫瘤體積比較 治療前4組荷瘤裸鼠間腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)不同治療后，4組間腫瘤體積兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 荷瘤裸鼠治療前后腫瘤體積及治療后的瘤質(zhì)量比較（n=10，±s）

表3 荷瘤裸鼠治療前后腫瘤體積及治療后的瘤質(zhì)量比較（n=10，±s）

**P<0.01；治療滿35 d體積和瘤質(zhì)量4組間兩兩比較均P<0.001

組別AP-DC+CIK組DC+CIK組CIK組生理鹽水組F治療前體積（cm3）2.417±0.173 2.421±0.132 2.421±0.138 2.463±0.153 0.211治療滿35 d體積（cm3）1.375±0.056 1.884±0.042 2.321±0.095 3.188±0.088 1 075.839**瘤質(zhì)量（mg）226.300±35.452 318.500±31.156 461.400±38.612 626.400±63.599 157.275**

2.6 荷瘤裸鼠治療前后瘤質(zhì)量和抑瘤率比較 4組荷瘤裸鼠瘤體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001），見表3。AP-DC+CIK組、DC+CIK組、CIK組抑瘤率分別為63.87%、49.15%、26.34%。

3 討論

乳腺癌目前在治療上包括手術(shù)切除、放療、化療以及特異靶向抗體等方法，但療效均不明顯，最終都會出現(xiàn)腫瘤的耐藥和復(fù)發(fā)。對于原發(fā)和繼發(fā)耐藥機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了多項(xiàng)研究，其中在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族研究中發(fā)現(xiàn)P-gp是耐藥機(jī)制重要原因之一[3]。腫瘤的生物免疫治療已經(jīng)為解決腫瘤耐藥問題帶來了希望。

CIK細(xì)胞是來源于T淋巴細(xì)胞的具有免疫活性的異質(zhì)細(xì)胞群，具有較強(qiáng)的抗腫瘤毒性,可以殺傷對化療耐藥的腫瘤細(xì)胞，是治療多藥耐藥腫瘤最具潛力的途徑。DC細(xì)胞作為最具潛力的抗原提呈細(xì)胞，可以識別、加工、提呈抗原給T細(xì)胞[4],是激發(fā)特異性免疫應(yīng)答的中心和抗腫瘤免疫的重要載體。臨床研究中發(fā)現(xiàn)部分患者在用免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行過繼免疫治療時(shí)療效不太理想,認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞對這些免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生了抵抗,可能與腫瘤患者功能性的DC缺乏、T細(xì)胞的免疫無能有關(guān)。隨著CIK細(xì)胞在腫瘤過繼免疫治療中的作用越來越突出，DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞相互作用后，CIK細(xì)胞可以被激活并殺傷腫瘤抗原分子。故針對多藥耐藥基因而進(jìn)行的DC與CIK細(xì)胞之間的研究將成為重點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，CIK細(xì)胞與DC共育后，CIK細(xì)胞的增殖速率較CIK細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)進(jìn)一步增加，為單獨(dú)CIK組的近20倍，其中以AP-DC+CIK組倍數(shù)最高，說明DC能促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖，抗原負(fù)載后的DC促增殖能力更強(qiáng)。CD3+CD56+細(xì)胞和CD3+CD8+細(xì)胞是CIK細(xì)胞中發(fā)揮細(xì)胞毒活性的主要細(xì)胞群。CD3+CD56+細(xì)胞在未培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞中所占極微（1%～5%），培養(yǎng)后其比例大幅增高，AP-DC+CIK組表達(dá)最高，其次是DC+CIK組，CIK組表達(dá)最低，提示在CIK與DC共育后，CIK細(xì)胞中CD3+CD56+細(xì)胞大量擴(kuò)增，特別是負(fù)載抗原的DC能最大程度擴(kuò)增CD3+CD56+細(xì)胞，CD3+CD8+細(xì)胞亦如此，在AP-DC+CIK組擴(kuò)增最明顯，提示CIK細(xì)胞在DC刺激下成熟度增加，負(fù)載抗原的DC能進(jìn)一步增加CIK細(xì)胞的成熟度，殺傷能力亦隨之增加，從表型分析提示AP-DC+CIK組的殺傷能力最強(qiáng)。進(jìn)一步檢測CIK細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2的能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，AP-DC+CIK組表達(dá)高，其次是DC+CIK組，CIK組表達(dá)最低，提示DC能激發(fā)CIK分泌細(xì)胞因子的潛力，而負(fù)載抗原的DC可進(jìn)一步增加細(xì)胞因子的分泌。分泌細(xì)胞因子亦是CIK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制之一，其活化后可以增加上述細(xì)胞因子的分泌量，提高殺瘤活性[5]，故本結(jié)果亦能支持與DC共培養(yǎng)后，CIK殺傷腫瘤能力增強(qiáng)，與負(fù)載抗原的DC共育后，其殺傷能力進(jìn)一步增強(qiáng)。同時(shí)有研究顯示，CIK細(xì)胞對DC的成熟也有很大的促進(jìn)作用并上調(diào)相應(yīng)成熟表型表達(dá)[6]，從而成熟DC可以進(jìn)一步增加CIK的成熟度和殺傷能力，起到正向促進(jìn)作用。

筆者前期研究提示，在對表達(dá)P-gp抗原的MCF-7/ADR乳腺癌耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒進(jìn)行殺傷時(shí)，AP-DC+CIK組的殺傷效應(yīng)最強(qiáng)，其次是DC+CIK組，CIK組的殺傷效應(yīng)最弱[7]。本研究在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到同樣結(jié)論，AP-DC+CIK組腫瘤抑制率最高，CIK單獨(dú)治療組腫瘤抑制率最低，提示CIK對腫瘤細(xì)胞有殺傷抑制作用，DC激活CIK細(xì)胞后殺傷能力得到增強(qiáng)，而負(fù)載腫瘤抗原的DC激活的CIK細(xì)胞殺傷能力最強(qiáng)，致使AP-DC+CIK組小鼠腫瘤體積最小，瘤體質(zhì)量重最輕，抑瘤率最高。其機(jī)制可能為CIK細(xì)胞將耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于S和G2/M期的同時(shí),誘導(dǎo)其凋亡,降低耐藥基因的表達(dá),提高耐藥細(xì)胞的免疫原性,分泌細(xì)胞質(zhì)顆粒，分泌穿孔蛋白（PFP），產(chǎn)生IL-2、TNF-α、INF-γ、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等具有抗腫瘤活性的細(xì)胞因子發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。DC與CIK細(xì)胞共作用后，CIK細(xì)胞的殺傷能力進(jìn)一步增強(qiáng)，其作用機(jī)制可能為:（1）DC高表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）-Ⅱ類分子（HLA-DR）和共刺激分子使CIK細(xì)胞充分接受第二信號激活,激活的CIK細(xì)胞通過免疫球蛋白Fc受體使淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原（LFA）-1和細(xì)胞間黏附分子（ICAM）-1的結(jié)合從低親和力轉(zhuǎn)為高親和力,并向細(xì)胞間排出含有α-氮-甲苯碳酰基-左旋-賴氨酸硫甲苯酯（BLT）的胞漿毒性顆粒,引發(fā)胞漿毒性顆粒依賴性溶細(xì)胞作用。（2）DC分泌多種細(xì)胞因子,刺激抗原特異性T細(xì)胞增殖,促進(jìn)CIK的活化和分化，間接啟動CIK[9]。本研究中，表達(dá)P-gp的MCF-7/ADR細(xì)胞抗原沖擊的DC和CIK共培養(yǎng)后，能顯著激活CIK細(xì)胞對MCF-7/ADR細(xì)胞的殺傷作用，提示CIK細(xì)胞除了其非MHC限制性殺傷作用，很有可能存在一定的特異性殺傷效應(yīng)，其機(jī)制可能為CIK細(xì)胞中存在能夠識別特異抗原的殺傷細(xì)胞[10]，進(jìn)而產(chǎn)生特異性殺傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于進(jìn)一步探究對多藥耐藥腫瘤的獲得性免疫治療。

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