花生AhNCED1重組蛋白原核表達(dá)與二級(jí)結(jié)構(gòu)初步分析

胡 博，李嘉怡，游瓊英

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510631)

脫落酸(ABA,Abscisic acid)是一種重要的植物激素,參與植物胚胎發(fā)育、種子休眠、果實(shí)成熟以及逆境脅迫等許多方面,對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起著調(diào)節(jié)作用[1].生物化學(xué)和遺傳學(xué)研究結(jié)果證明，9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, 簡(jiǎn)稱NCED)是調(diào)控ABA生物合成的關(guān)鍵酶[2-4].其催化C40的9-順式紫黃質(zhì)和9’-順式新黃質(zhì)發(fā)生裂解，形成ABA的前體物質(zhì)-黃質(zhì)醛(Xanthoxin)(C15)[5].

SCHWARTZ等[5]發(fā)現(xiàn)，重組VP14蛋白(NCED)可催化9-順式紫黃質(zhì)或9’-順式新黃質(zhì)的裂解反應(yīng)，玉米葉片萎蔫時(shí)VP14基因的誘導(dǎo)表達(dá)與ABA水平的增加成平行關(guān)系.隨后在擬南芥[6]、菜豆[7]、番茄[8]、豇豆[9]、鱷梨[10]、葡萄[11]和柑橘[12]中均克隆了NCED基因.2005年，WAN 和 LI 等[13]從花生葉片中克隆得到AhNCED1 (Arachishypogaea9-cis- epoxycarotenoid dioxygenase )，證明AhNCED1具有NCED基因功能，其蛋白與菜豆PvNCED1[7]、 豇豆VuNCED1[9]、 番茄LeNCED1[8]及擬南芥 AtNCED3[6]分別有75%、 74%、71%和68%的同源性，C-端高度同源，保守結(jié)構(gòu)域簇集在4個(gè)組氨酸周圍；N-端氨基酸同源性低但結(jié)構(gòu)相似，富含堿性氨基酸，具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽.擬南芥129B08/nced3突變體不能累積ABA，對(duì)水分脅迫敏感，AhNCED1轉(zhuǎn)化129B08/nced3突變體，獲得的轉(zhuǎn)基因植株可以降低其對(duì)水分脅迫的敏感性.外施ABA能回復(fù)129B08/nced3突變體的表型，說(shuō)明AhNCED1基因參與水分脅迫時(shí)ABA的生物合成[14].但有關(guān)NCED蛋白的原核表達(dá)、純化以及結(jié)構(gòu)尚不了解.本研究誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，研究重組蛋白在正常和水分脅迫以及SDS條件下二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，為認(rèn)識(shí)AhNCED1蛋白功能提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

花生(ArachishypogaeaL.)材料為粵油7號(hào)，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院梁炫強(qiáng)研究員提供；大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌DH5a和重組質(zhì)粒PMD18T-AhNCED1為本實(shí)驗(yàn)室保存.原核表達(dá)載體為pPRoEX HTa系統(tǒng)購(gòu)自GIBCOL/BRL公司.成年雄性新西蘭兔2.5 kg，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心.

菌液裂解液：含50 mmol/L(pH8.0)Tris base、2 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl;結(jié)合緩沖液：50 mmol/L pH8.0 NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L 咪唑;基礎(chǔ)緩沖液：50 mmol/L This HCl,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L GSSG,5 mmol/L GSH,10%甘油，10 mmol/L PMSF;PBS緩沖液：135 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，1.5 mmol/L KH2PO4，and 8 mmol/L K2HPO4;TTBS緩沖液： Tris 6.055 g;NaCl,43.83 g;0.5% Tween-20;pH7.6.

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建ECORⅠ和PSTⅠ酶切PMD18T-AhNCED1質(zhì)粒，回收AhNCED1基因片段后與pPRoEX HTa的載體片段在T4連接酶的作用下4 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21.PCR鑒定(Ah-F： 5’CCA TGG CAG CAA CTT CAA ACA CAT G-3’；Ah-R： 5’CCA TGG CGG CCG CCT TTT GTA TAA G-3’)以及ECORⅠ和PSTⅠ雙酶切驗(yàn)證鑒定陽(yáng)性重組克隆.

1.2.2 AhNCED1重組蛋白的表達(dá) 將重組質(zhì)粒pPRoEX HTa-AhNCED1的E.coliBL21(DE3)接種至含有氨芐青霉素(amp)(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 h，至OD600在0.5～0.8之間.加入異丙基硫代半乳糖(IPTG)誘導(dǎo)劑， IPTG濃度0.2 mmol/L,28 ℃，誘導(dǎo)4 h后收集菌體，菌液裂解液懸浮菌體，加入溶菌酶至1 mg/mL，超聲波破碎細(xì)胞， SDS-PAGE 分析蛋白表達(dá)情況.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%.考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3 h，乙醇脫色液脫色至背景無(wú)色.

1.2.3 重組蛋白的性質(zhì)分析 等體積Bug Buster reagent重懸菌體細(xì)胞沉淀，加入rlysozyme溶液至終濃度為1 kU/mL.室溫5 min.加入6倍體積1∶10的Bug Buster reagent于懸浮液中， 5 000 r/min離心15 min.包涵體加入0.5倍體積1∶10的Bug Buster reagent，在4 ℃，5 000 r/min離心15 min.重復(fù)，16 000 r/min在4 ℃離心15 min.重懸沉淀，根據(jù)Version[15]方法檢測(cè)重組蛋白可溶性.

取1 mL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h的菌液，4 000 r/min離心10 min，收集菌體；用PBS緩沖液洗滌2次，加入100 μL PBS緩沖液重懸菌體；懸液分別在85 ℃和95 ℃條件下加熱處理15 min；4 ℃、14 000 r/min離心20 min；SDS-PAGE電泳分析上清液蛋白，檢測(cè)重組蛋白熱穩(wěn)定性.

1.2.4 重組蛋白的純化 1×結(jié)合緩沖液重懸菌體細(xì)胞，加入溶菌酶至1 mg/mL，冰浴30min，超聲波破碎.10 000 r/min 離心5 min保留上清裂解液，-20 ℃留樣檢測(cè).在4×上清液中加1×Ni-NTA純化柱介質(zhì)懸浮液，混勻，吸去上清液，加4×結(jié)合緩沖液和介質(zhì)懸浮液混勻，4 ℃結(jié)合1 h，過(guò)柱，4 ×洗滌緩沖液洗介質(zhì)4次，用0.5×洗脫緩沖液洗脫介質(zhì)上的蛋白4次，收集柱液，用SDS-PAGE分析樣品，BCA法測(cè)定蛋白濃度.

1.2.5 多克隆抗體的制備與特異性檢測(cè) 切下SDS-PAGE電泳目的條帶，研碎，與1 mL弗氏佐劑完全混勻后對(duì)新西蘭兔進(jìn)行背部和腹股溝多點(diǎn)皮下注射.1周后同樣處理研磨的樣品與1mL弗氏不完全佐劑混勻后再次免疫家兔，間隔1周后重復(fù)1次，共2次，取血.血液在37 ℃溫育1 h，4 ℃過(guò)夜，吸取上清，ELSIA法檢測(cè)抗體.

參照J(rèn)OVANOVIC等[3]方法抽提植物總蛋白，-20 ℃保存?zhèn)溆?將AhNCED1-pProEX HTa 表達(dá)菌蛋白，pProEX HTa表達(dá)菌蛋白及花生粵油7號(hào)四葉期葉片蛋白SDS-PAGE檢測(cè)后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1 h．抗血清稀釋1 000倍后雜交反應(yīng)1 h，TTBS 3次漂洗，羊抗兔標(biāo)記抗體2次雜交，TTBS漂洗3次.TBS漂洗1次后NBT-NCIP染色、顯色.

1.2.6 AhNCED1蛋白圓二色譜(CD譜)測(cè)定 將洗脫的蛋白依次在加有0、2、4、6、8mol/L尿素的基礎(chǔ)緩沖液中4 ℃透析4～8 h,最后在pH7.4的PBS緩沖液中透析過(guò)夜.用J-715圓二色譜儀(JASCO,JAPAN)在波長(zhǎng)范圍為190～250 nm，掃描速度100 nm/min，靈敏度 (Sensitivity):20mdeg，帶寬(Bandwidth)：1.0 nm測(cè)定CD譜，用Jascow32軟件分析計(jì)算.

2 結(jié)果與分析

2.1 AhNCED1重組蛋白的原核表達(dá)

AhNCED1酶切片段與pPRoEX HTa載體連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞.挑選陽(yáng)性重組子經(jīng)PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示有特異條帶(約1 840 bp)(圖1)，與預(yù)期的理論分子質(zhì)量(1 822 bp)相近.

圖1 重組質(zhì)粒pProEX HTa-AhNCED1的PCR產(chǎn)物Figure 1 PCR products of recombinant plasmid pProEX HTa-AhNCED1

M：Marker DL2000;1:負(fù)對(duì)照;2：正對(duì)照;3:pProEX HTa-AhNCED1 PCR產(chǎn)物

雙酶切檢測(cè)分別得到的片段pPRoEX HTa(2.8 kb)和1.8 kb的插入片段(AhNCED1)(圖2),表明AhNCED1片段定向插入pPRoEX HTa載體中.陽(yáng)性重組子命名為pPRoEX HTa-AhNCED1，簡(jiǎn)稱pPR-AhN.

圖2 pProEX HTa-AhNCED1質(zhì)粒雙酶切圖Figure 2 Identification of recombinant plasmid pProEX HTa-AhNCED1 digested with ECORⅠand PSTⅠ

M：Marker DL2000;1:質(zhì)粒ECORⅠ和PSTⅠ雙酶切;2：pProEX HTa空載體對(duì)照

pPRoEX HTa-AhNCED1融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物分子量約為65.0 ku(圖3).與理論預(yù)計(jì)值66.86 ku相近.表明重組菌在IPTG誘導(dǎo)下可以表達(dá)目的蛋白.

圖3 AhNCED1-pPROEX HTa融合蛋白SDS-PAGE電泳圖Figure 3 SDS-PAGE analysis of fusion protein of pPROEX-Hta-AhNCED1

1： 空載體菌表達(dá)對(duì)照;2： AhNCED1-pPROEX HTa融合蛋白表達(dá);M：蛋白分子質(zhì)量Marker

2.2 AhNCED1重組原核蛋白的性質(zhì)

圖4結(jié)果表明，表達(dá)蛋白存在于分離后的上清液中(第3泳道)，為可溶性蛋白.

IPTG誘導(dǎo)重組菌體蛋白經(jīng)85 ℃和95 ℃熱處理15 min后，大部分蛋白已消失，而融合蛋白的特異條帶仍然清晰可辨(圖5).表明AhNCED1融合蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性.

圖4 AhNCED1可溶性與非可溶性蛋白分離的SDS-PAGE檢測(cè)

Figure 4 SDS-PAGE analysis of AhNCED1 expressed inE.colitransformants harboring pProEX-HTa-AhNCED1

1：總蛋白;2：包涵體中非可溶性蛋白;3：上清液中可溶性蛋白;M：蛋白分子質(zhì)量Marker

圖5 AhNCED1融合蛋白熱穩(wěn)定性的SDS-PAGE檢測(cè)Figure 5 SDS-PAGE analysis of thermal stability of AhNCED1 fusion protein

M：蛋白分子質(zhì)量Marker;1：對(duì)照;2：85 ℃;3：95 ℃

正常條件下，重組蛋白經(jīng)純化復(fù)性后，在圓二色譜儀190～240 nm遠(yuǎn)紫外掃描(N2流速3 L/min，10 mdeg， 20 nm/min )201 nm時(shí)出現(xiàn)1個(gè)負(fù)峰(圖6)，在此波長(zhǎng)出現(xiàn)負(fù)峰屬于不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu).水分脅迫處理AhNCED1-pProEX HTa重組菌，分離純化的重組蛋白，在225 nm出現(xiàn)1個(gè)負(fù)峰(圖6)，為典型的a螺旋型結(jié)構(gòu)，Helix增加61.6%，Beta和Random分別降低19.4%和41.3%(表1).

表1 PEG對(duì)AhNCED1融合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響%
Table 1 Influence of PEG on secondary structure of AhNCED1 fusion protein CD spectra

Treatmentα-Helix β-SheetRandom Turn擬核率(RMS)30%PEG82.51.115.50.990.637Control20.920.556.81.891.549

圖6 PEG對(duì) AhNCED1 融合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Figure 6 Circular dichroism spectroscopic analysis of AhNCED1 fusion protein and influence of PEG on secondary structure of the protein

a：PEG處理;b：對(duì)照

2.3 AhNCED1蛋白多克隆抗體特異性分析

蛋白經(jīng)Superflow柱純化洗脫后，分析buffer D組

和buffer E組洗脫液，隨著洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，重組蛋白純化單一.D1中出現(xiàn)一些雜的條帶，E3已純化為單一蛋白條帶(圖7).

圖7 AhNCED1-pPROEX HTa融合蛋白的Ni2+親和純化Figure 7 SDS-PAGE analysis of Ni2+ affinity purified pPROEX-HTa-AhNCED1 protein.

M：蛋白分子質(zhì)量;T：純化前總蛋白分析;D1-4 和 E1-4：Ni2+親和純化后分析

抗血清anti-AhN1可以識(shí)別工程菌的重組AhNCED1-pProEX HTa 融合蛋白，在66.2KD處出現(xiàn)深色的目的條帶(圖8)，對(duì)照菌pProEX HTa融合蛋白沒(méi)有出現(xiàn)特異性雜交條帶產(chǎn)生.Western blotting 分析anti-AhN1抗血清，發(fā)現(xiàn)在花生葉片中特異識(shí)別一條分子量約為66.0 ku條帶(圖8)，與花生AhNCED1蛋白的分子質(zhì)量一致，免疫前血清相同位置無(wú)識(shí)別條帶.說(shuō)明anti-AhN1抗血清可以特異識(shí)別花生AhNCED1.

M：蛋白分子質(zhì)量

3 討論

ABA是逆境下觸發(fā)植物對(duì)逆境脅迫發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)的傳遞體，參與調(diào)控植物對(duì)脅迫產(chǎn)生的應(yīng)答[16]，NCED基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)脅迫條件的抗性[17].AhNCED1序列含有1個(gè)完整開(kāi)放閱讀框，編碼由601個(gè)氨基酸組成的多肽，分子質(zhì)量為66.86 ku，等電點(diǎn)為8.39，無(wú)內(nèi)含子[13].本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)構(gòu)建花生AhNCED1基因原核表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)在0.2 mmol/L、4 h、28 ℃的條件下目的蛋白以可溶形式高效表達(dá)，分子質(zhì)量在66.0 ku左右(圖4)，這與WAN等的序列分析結(jié)果一致[13].在該蛋白的N端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，能夠與Ni-NTA 樹(shù)脂的Ni2+特異性螯合，利用這一特性，可以采用Ni-NTA親和柱純化出高純度的蛋白.蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性與維持它們內(nèi)部立體結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵，尤其是氫鍵、S—S鍵等的存在和數(shù)量有關(guān)[18].AhNCED1蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性，即使在95 ℃的高溫，也能維持其內(nèi)部的結(jié)構(gòu)與蛋白的分子質(zhì)量.

本實(shí)驗(yàn)制得的AhNCED1蛋白抗體識(shí)別原核表達(dá)的重組蛋白，并特異識(shí)別天然AhNCED1蛋白(圖7). 蛋白質(zhì)肽鏈中沒(méi)有規(guī)律的那部分肽段構(gòu)象.其結(jié)構(gòu)比較松散，與α-螺旋、β-折疊片、β-轉(zhuǎn)角比較起來(lái)沒(méi)有確定規(guī)律，但是對(duì)于一些蛋白質(zhì)分子無(wú)規(guī)卷曲特定構(gòu)象是不能被破壞的，否則影響整體分子構(gòu)象和活性.無(wú)規(guī)卷曲(randon coil)它泛指那些不能被歸入明確的二級(jí)結(jié)構(gòu)如明確的二級(jí)結(jié)構(gòu)如折疊片或螺旋的多肽區(qū)段.這些“無(wú)規(guī)卷曲”有明確而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu).它們受側(cè)鏈相互作用的影響很大.這類有序的非重復(fù)性結(jié)構(gòu)經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位和其他蛋白質(zhì)特異的功能部位.AhNCED1重組蛋白具有典型的不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，其Random達(dá)到56.8%(表1).高比例的隨機(jī)卷曲使重組蛋白具有較高的水和能力,可能以結(jié)合水份的方法，防止細(xì)胞在干旱脅迫時(shí)流失水份[18].30%PEG6000處理重組菌3 h引起重組蛋白Helix由20.9%顯著上升到82.5%(表1).說(shuō)明Helix比例的升高與重組蛋白的高親水性相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞受滲透脅迫時(shí)，重組蛋白被誘導(dǎo)從無(wú)序卷曲狀態(tài)形成高比例的a-螺旋.其親水面可與水分子結(jié)合，從而起到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用[18].SDS為雙極性分子，在水溶液中可自發(fā)形成微膠束，是一種類似單層生物膜的結(jié)構(gòu).根據(jù)此特性SDS常被用于研究膜蛋白與膜之間的相互作用[19].當(dāng)純化復(fù)性后的蛋白溶液加入5%SDS后，Helix從20.9%上升到41.2%，重組蛋白被誘導(dǎo)產(chǎn)生出α-螺旋，可推測(cè)此蛋白可能通過(guò)與細(xì)胞膜發(fā)生相互作用，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能.

本論文結(jié)果為進(jìn)一步研究花生AhNCED1蛋白與其他相關(guān)蛋白的相互作用及其AhNCED1蛋白在花生響應(yīng)水分脅迫過(guò)程中的分布奠定了基礎(chǔ)，有利于闡明脫落酸在調(diào)控植物逆境脅迫中的作用.

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