X染色體連鎖凋亡抑制蛋白的表達(dá)、純化及多抗血清的制備①

馬瑞娟 孫敏英 楊學(xué)習(xí) 徐偉文 (南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣州510515)

凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein，IAPs)是一類在結(jié)構(gòu)上具有同源性的細(xì)胞內(nèi)源性凋亡抑制蛋白家族。人類IAPs的主要成員有X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)、cIAP1、cIAP2、生存素 survivin、livin、神經(jīng)元凋亡抑制蛋白NIAP等[1]。X-染色體連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員，是Liston等于1996年運(yùn)用DNA印跡和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在人胚胎腦組織中克隆出的，其基因位于X染色體q24-25，含有497個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為54 kD的蛋白質(zhì)，其蛋白氨基端由3個(gè)BIR區(qū)域和羧基端1個(gè)環(huán)狀鋅指結(jié)構(gòu)組成[2]。XIAP可以通過直接與 caspase-9、caspase-3、caspase-7結(jié)合來抑制caspase活性，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[3]。研究發(fā)現(xiàn)XIAP表達(dá)于大多數(shù)的腫瘤組織，而在正常組織中不表達(dá)，與腫瘤的進(jìn)展、復(fù)發(fā)、預(yù)后以及腫瘤化療的耐藥性密切相關(guān)，可能是腫瘤診治的新靶點(diǎn)[4-7]。本研究構(gòu)建XIAP原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)了XIAP重組蛋白并通過親和層析純化得到高質(zhì)量的重組蛋白，免疫BALB/c小鼠，獲得高效價(jià)多抗血清，希望能為人X染色體連鎖凋亡抑制蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究及診斷試劑的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 原核表達(dá)載體pET30a(+)、大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存;人XIAP重組載體pET30a(+)/XIAP由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建;IPTG、考馬斯亮藍(lán) R250和Kan購(gòu)于Sigma公司;Ni-Separose填料購(gòu)于GE公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)pET30a(+)和 pET30a(+)/XIAP轉(zhuǎn)化的 BL21(DE3)單克隆于LB(Kan+)液體培養(yǎng)基中37℃，200 r/min過夜培養(yǎng);次日以1∶200的比例轉(zhuǎn)接于新的LB(Kan+)培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度1 mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)對(duì)照，離心收集菌體，取樣用上樣緩沖液懸浮沉淀后100℃煮沸5分鐘，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色后觀察結(jié)果。

1.2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的大量表達(dá) 接種pET30a(+)/XIAP轉(zhuǎn)化BL21(DE3)單克隆于含有50 ml液體LB(Kan+)培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)物以1∶200的量接種于新的含有600 ml液體 LB(Kan+)培養(yǎng)基的2 L三角瓶中，于37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度1 mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。4℃、8 000 r/min離心收集菌體。1 L培養(yǎng)物以25 ml結(jié)合緩沖液(具體物質(zhì)及具體濃度)懸浮，1∶1 000加入 β-巰基乙醇，1∶10加入10 mg/ml的溶菌酶母液。反復(fù)凍融3個(gè)循環(huán)，冰浴超聲破碎菌體后離心，分別收集上清、沉淀。SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色后觀察結(jié)果。

1.2.3 包涵體的洗滌 蛋白包涵體表達(dá)時(shí)，1 L培養(yǎng)物超聲后沉淀加入25 ml含2 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液懸浮，懸浮后振搖30分鐘，離心，保留上清。沉淀用25 ml含4 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液懸浮，懸浮后振搖30分鐘，離心，保留上清。沉淀用20 mol含8 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液懸浮，離心并保留上清和沉淀。每次離心的上清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色后觀察結(jié)果。

1.2.4 重組蛋白的純化及復(fù)性 包涵體洗滌后上清用0.22 μm濾膜過濾，Ni-Sepharose親和層析純化重組蛋白。具體步驟如下述，純化柱經(jīng)5個(gè)柱體積的含8 mol/L尿素的Binding buffer平衡后，過濾后樣品上柱，流速為2 ml/min，用含8 mol/L尿素的Binding buffer平衡至基線后再用Elutiong buffer(20 mmol/L NaH2PO4，0.5 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH=8.0)洗脫，收集峰值樣品。SDS-PAGE電泳觀察結(jié)果。純化后樣品依次在尿素濃度為6、4、2和0 mol/L的PBS溶液透析4小時(shí)，去除蛋白溶液中的尿素使蛋白復(fù)性，復(fù)性后樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.5 重組蛋白的Western blot鑒定 純化后重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，依次經(jīng)過5%(W/V)奶粉封閉、TBST洗滌、抗His抗體處理、TBST洗滌、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育、化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)、X光片曝光和光密度掃描儀采集X光片上的圖像。

1.2.6 抗血清的制備及鑒定 將50 μg抗原與等體積皂土佐劑充分混合，皮下、腹股溝、腹腔多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠，間隔兩周同樣的方法免疫一次，再間隔兩周腹腔注射加強(qiáng)免疫，一周后采血。分離血清，通過ELISA檢測(cè)抗血清的效價(jià)。用純化重組蛋白包被96孔板，4℃過夜;37℃封閉2小時(shí)，倍比稀釋的小鼠血清37℃孵育1小時(shí)。1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗37℃孵育45分鐘。TMB顯色，測(cè)定450 nm處測(cè)A值。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體pET30a(+)/XIAP的誘導(dǎo)表達(dá) 分別誘導(dǎo)原核表達(dá)載體pET30a(+)、重組載體pET30a(+)/XIAP轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)單克隆菌株。SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖1所示，pET30a(+)/XIAP轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的樣品在分子量54 kD附近出現(xiàn)明顯條帶，pET30a(+)/XIAP轉(zhuǎn)化菌未誘導(dǎo)的樣品、pET30a(+)轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)樣品、pET30a(+)轉(zhuǎn)化菌未誘導(dǎo)樣品皆沒有相應(yīng)條帶的出現(xiàn)(圖1)。同重組蛋白的理論值54 kD一致，表明重組蛋白可以誘導(dǎo)表達(dá)。

2.2 pET30a(+)/XIAP的大量表達(dá)及包涵體的洗滌 收集大量表達(dá)pET30a(+)/XIAP的菌體，結(jié)合使用溶菌酶、凍融和超聲的方法破碎菌體。菌體破碎后上清和沉淀的SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果顯示重組蛋白主要存在于沉淀中，上清中幾乎沒有重組蛋白，即重組蛋白以包涵體形式表達(dá)(圖2泳道1、2)。沉淀用含有2 mol/L和4 mol/L尿素的Binding buffer洗滌去除雜蛋白后用含有8 mol/L尿素的Binding buffer溶解。SDS-PAGE電泳檢測(cè)表明2 mol/L和4 mol/L尿素的洗滌可以去除部分雜蛋白(圖3泳道1、3)，而大部分重組蛋白仍然存在于沉淀中(圖3泳道2、4)。含有8 mol/L尿素的Binding buffer可以溶解大部分的重組蛋白(圖3泳道5)，但沉淀中仍有少量重組蛋白的存在(圖3泳道6)。

圖1 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE analysis for the expression product of pET-30a(+)/XIAP

圖2 超聲破碎后SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis for the lysed

2.3 重組蛋白的純化及復(fù)性 過濾后的樣品經(jīng)Ni-Sepharose親和層析進(jìn)行重組蛋白的純化。純化的樣品通過梯度透析進(jìn)行復(fù)性。SDS-PAGE電泳分析純度達(dá)到90%以上(圖4)。

2.4 重組蛋白的Western blot鑒定 純化后重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，依次經(jīng)過5%(W/V)奶粉封閉、TBST洗滌、抗His抗體處理、TBST洗滌、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育、化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)、X光片曝光和光密度掃描儀采集X光片上的圖像。在約54 kD的位置出現(xiàn)目的條帶如圖5所示，表明純化的重組蛋白是帶His標(biāo)簽的目的蛋白。

圖3 重組蛋白包涵體洗滌SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis for the dissolve inclusion bodies of recombinant protein

圖4 重組蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis for purified protein

表1 ELISA檢測(cè)XIAP重組蛋白抗血清的效價(jià)結(jié)果Tab.1 ELISA for titer of XIAP recombinant protein antiserum

圖5 Western blot鑒定重組蛋白結(jié)果Fig.5 Identification by Western blot

2.5 XIAP重組蛋白抗血清的效價(jià)的檢測(cè) 見表1。

3 討論

XIAP是人類細(xì)胞內(nèi)源性凋亡抑制蛋白家族的成員之一，研究發(fā)現(xiàn)XIAP基因在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞株中過度表達(dá)，廣泛表達(dá)于多種成年人腫瘤及胚胎組織中，通過與TRAF1和TRAF2結(jié)合抑制凋亡，與細(xì)胞凋亡調(diào)控的紊亂及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變具有十分密切的關(guān)系，在腫瘤的進(jìn)展、復(fù)發(fā)、預(yù)后以及腫瘤化療的耐藥性等事件上均有重要相關(guān)性[8-10]。

如Mizutani等[11]的研究表明在90%的腎細(xì)胞癌中表達(dá)XIAP，其中高表達(dá)XIAP的透明細(xì)胞腎癌達(dá)35% ～50% ，隨著分期和核分級(jí)的升高，高表達(dá)XIAP的比率也增加。五年的生存分析表明XIAP為腎細(xì)胞癌一個(gè)獨(dú)立不良的預(yù)后因素。Tanaka等[12]、張穎超[13]在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn) XIAP 的陽性率為70.5%以上，而在癌旁正常乳腺組織中無表達(dá)，提示XIAP蛋白在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展不同階段呈不同程度的表達(dá)，過度表達(dá)提示預(yù)后不良。Hofmann等[14]運(yùn)用肺癌的組織標(biāo)本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)和免疫印跡研究XIAP的表達(dá)，認(rèn)為XIAP是促進(jìn)腫瘤發(fā)生的重要因子。Shiraki等[15]發(fā)現(xiàn)XIAP在肝癌細(xì)胞與癌組織中表達(dá)升高，而正常的肝細(xì)胞與肝組織中卻呈低表達(dá)狀態(tài)。XIAP可能通過細(xì)胞的凋亡調(diào)控參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展，它的過表達(dá)與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，為肝癌發(fā)生預(yù)測(cè)和早期診斷新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證提供了一定的研究依據(jù)[16]。然而在膽脂瘤中XIAP的表達(dá)明顯下調(diào)，與膽脂瘤上皮的凋亡密切相關(guān)，提示XIAP可能參與膽脂瘤上皮的凋亡調(diào)控過程，在膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，可見其參與凋亡的功能具有復(fù)雜性，或許還有不同組織細(xì)胞的選擇性[17]。

另外有研究發(fā)現(xiàn)XIAP也在其他一些非腫瘤疾病中起著重要的作用。如Mufti等[18]發(fā)現(xiàn)，在 Wilson病、其他銅代謝紊亂和培養(yǎng)細(xì)胞的高銅水平時(shí)，XIAP能大大降低細(xì)胞內(nèi)銅聚集。通過 XIAP調(diào)控細(xì)胞凋亡和銅排泄可以降低細(xì)胞內(nèi)銅水平，為Wilson病提供了可能的治療途徑。XIAP還參與帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、癲癇等許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程，涉及了疾病的發(fā)病機(jī)制[19-22]。進(jìn)一步深入研究它們的相互調(diào)控機(jī)制，將為許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的多靶點(diǎn)防治提供選擇。

綜上所述，XIAP與很多腫瘤及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，進(jìn)一步深入和細(xì)致的功能研究還在進(jìn)行。本研究通過構(gòu)建XIAP原核表達(dá)載體，表達(dá)純化XIAP重組蛋白，制備多抗血清，可為XIAP蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究及診斷試劑的研制進(jìn)而應(yīng)用于臨床疾病診治奠定基礎(chǔ)。

1 Rajcan-Separovic E，Liston P，Lefebvre C et al.Assignment of human inhibitor of apoptosis protein(IAP)genes xiap，hiap-1，and hiap-2 to hromosomes Xq25 and 11q22-q23 by fluorescence in situ hybridization[J].Genomics，1996;37(3):404-406.

2 Fesik S W，Shi Y.Structural biology.Controlling the caspases[J].Science，2001;294(5546):1477-1478.

3 Holcik M，Gibson H.Korneluk RG1 XIAP:apoptotic brake and promising therapeutic target1[J].Apoptosis，2001;6(4):2532-2611

4 孫寶華.凋亡抑制蛋白與腫瘤[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·腫瘤學(xué)分冊(cè)，2000;27(增刊):3-6.

5 Sun C，Cai M，Meadows R P et al.NMR structure and mutagenesis of the third birdomain of the inhibitor of apoptosis protein XIAP[J].J Biol Chem，2000;275(43):33777-33781.

6 Nomura T，Mimata H，Takeuchi Y et al.The X-linked inhibitor of apoptosis protein ihhibits taxol induced apoptosis in LNCaP cell[J].Urol Res，2003;31(1):37-44.

7 Sasaki H，Sheng Y，Kotsuji F et al.Down regulation of X-linked inhibitor of apoptosis protein induces apoptosis in chemoresistant human ovarian cancer cells[J].Cancer Res，2000;60(20):5659-5666.

8 Tamm I，Komblau S M，Segall H et al.Expression and prognostic significance of IAP family genes in human cancer and myeloid leukemias[J].Clin Cancer Res，2000;6(5):1796-1803.

9 Bilim V，Kasahara T，Hara N et al.Role of XIAP in the malignant henotype of transitional cell cancer(TCC)and therapeutic activity of XIAP antisense oligonucleotides against multidrug-resistant TCC in vitro[J].Int J Cancer，2003;103(1):29-37.

10 Kim E H，Kim S U，Shin D Y et al.Roscovitine sensitizes glioma cell to TRAIL-mediated apoptosis by downregulation of surviving and XIAP[J].Oncogene，2004;23(2):446-456.

11 Mizutani Y，Nakanishi H，Li Y N et al.Over expression of XIAP expression inrenal cell carcinoma predict is a worse prognosis[J].Int J Oncol，2007;30(4):919-925.

12 Tanaka K，Iwmcto S，Coo G et al.Expression of XIAP and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas[J].Clin Cancer T-her，2000;13(6):127-134.

13 張穎超，王 禹，姜 洋et al.XIAP基因在乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中的表達(dá)及意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2005;31(6):915-917.

14 Hofmann H S，Simm A，Hammer A et al.Expression of inhibitor of apoptosis proteins(IAP)in non-small cell human lung cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，2002;128(10):554-560.

11 Shiraki K，Sugimoto K，Yamanaka Y et al.Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis in human hepatocellular carcinoma[J].Int J Mol Med，2003;12(5):705-708.

16 陶璐薇，林菊生，陳孝平 et al.肝細(xì)胞癌中XIAP mRNA及蛋白表達(dá)的意義[J].世界華人消化雜志，2004;12(12):2788-2791.

17 關(guān)芳靈.X連鎖凋亡抑制蛋白在膽脂瘤中的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].山西醫(yī)藥雜志，2000;37(6):492-494.

18 Mufti A R，Burstein E，Csomos R A et al.XIAP is a copper binding protein deregulated in wilson disease and other copper toxicosi disorders[J].Molecular Cell，2006;21(6):775-785.

19 Crocker S T，Liston P，Anisman H et al.Attenuation of MPTP-induced neurotoxicity and behavioural impairment in NSE XIAP transgenic mice[J].Neurobiol Dis，2003;12(2):150-161.

20 Yin K J，Lee J M，Chen S D et al.Amyloid-β induces Smac release via AP21/Bim activation in cerebral endothelial cells[J].J Neurosci，2002;22(22):9764-9770.

21 Goffredo D，Rigamonti D，Zuccato C et al.Prevention of cytosolic IAPs degradation:a potential pharmacological target in Huntington's disease[J].Pharmacol Res，2005;52(2):140-150.

22 Li T F，Luo Y M，Lu C Z.The expression of Smac and XIAP in rat hippocampus following limbic seizure induced by kainic acid injection into amygdaloid nucleus[J].Sheng Li Xue Bao，2004;56(2):172-177.