水通道蛋白4抗體測定的臨床意義①

邵文君 郭 濤 杜彥輝 (寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川750004)

視神經(jīng)脊髓炎(Neuromyelitis optica，NMO)，又稱Devic病、Devic綜合征，是一種先后或同時累及視神經(jīng)和脊髓的急性或亞急性脫髓鞘疾病[1]。由于視神經(jīng)脊髓炎和多發(fā)性硬化在臨床表現(xiàn)上的某些相似處及難以及時準(zhǔn)確的診斷，關(guān)于視神經(jīng)脊髓炎是一個獨(dú)立的疾病還是多發(fā)性硬化的一種臨床亞型一直都在備受關(guān)注的爭議，但是越來越多的研究證據(jù)表明，NMO是一種獨(dú)立的疾病。從2004年Lennon等[2]在 NMO患者血清中發(fā)現(xiàn)了一種特異性NMO-IgG 自身抗體到 2006 年 Wingerchuk 等[3，4]把血清NMO-IgG陽性列入NMO的診斷標(biāo)準(zhǔn)中，可見NMO-IgG抗體檢測對于支持診斷NMO的重要性，但是目前國內(nèi)此項(xiàng)抗體檢測手段尚不成熟，絕大多數(shù)醫(yī)院還未開展對NMO-IgG的檢測。我們采用間接免疫熒光方法檢測NMO-IgG抗體，熟悉NMO-IgG抗體測定的過程，并觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病及非脫髓鞘疾病的NMO-IgG測定結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)NMO-IgG抗體檢測的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2010年7月～2011年10月寧夏醫(yī)科大學(xué)依據(jù) Wingerchuk等[4]有關(guān) NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷為NMO的患者9例，均為女性，發(fā)病年齡17～31歲，病程1～6年，發(fā)病次數(shù)為2～5次;并收集同期住院的多發(fā)性硬化(Multiplesclerosis，MS)患者10例，均符合 2001年 Mcdonald診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];NMO的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]:根據(jù)患者出現(xiàn)急性起病，雙側(cè)同時或相繼發(fā)生的視神經(jīng)炎，急性橫貫性或播散性脊髓炎的臨床表現(xiàn)，結(jié)合MRI顯示視神經(jīng)和脊髓病灶，視覺誘發(fā)電位異常，CSF-IgG指數(shù)增高和出現(xiàn)寡克隆帶等。神經(jīng)科其他疾病患者46例，其中急性脊髓炎8例，脫髓鞘性脊髓炎5例，腦脊髓炎3例，腦血管病30例。

1.2 方法

1.2.1 血清制備 取得患者或監(jiān)護(hù)人知情同意簽字后，抽取研究對象清晨空腹靜脈血標(biāo)本3～5 ml，進(jìn)行離心(轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心10分鐘)，取上層血清，儲存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 普通成年小白鼠腦組織冰凍切片 輕柔地取出完整的成年小白鼠腦組織，無過度牽拉和破損，取小鼠腦干和小腦部分制備成10 μm的腦片，4%甲醛固定后保存于-80℃冰箱備用。

1.2.3 NMO-IgG的檢測 取出制備好的腦片，10%正常山羊血清封閉，37℃、30分鐘;用PBS漂洗三次;加血清標(biāo)本(稀釋度為1∶150)，37℃孵育1小時;PBS漂洗三次;加熒光素標(biāo)記抗體FITC羊抗人IgG(抗體稀釋度為1∶100)，避光，37℃孵育30分鐘;PBS避光漂洗三次;避光DAPI染核10分鐘，PBS再漂洗三次;直接封片后盡快置于熒光顯微鏡下觀察，即間接免疫熒光法檢測各組血清NMO-IgG抗體。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。特異性=抗體檢測陰性的例數(shù)/患者組非NMO疾病譜例數(shù)×100%，敏感性=抗體檢測陽性的例數(shù)/患者組屬NMO疾病譜例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

對配對四格表資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果提示臨床診斷NMO及非NMO病例組患者應(yīng)用NMO-IgG定性檢測陽性率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

血清AQP4抗體檢測陽性如圖1所示，NMO與非NMO患者血清NMO-IgG抗體檢測結(jié)果如表1所示，9例 NMO患者血清 NMO-IgG陽性 8例(88.9%);10例MS患者NMO-IgG陽性2例(20%);神經(jīng)科其他疾病患者陽性2例(4.3%)，其中急性脊髓炎1例，腦脊髓炎1例。其余患者AQP4抗體檢測均為陰性(見圖2)。NMO-IgG抗體方法診斷NMO的敏感性88.9%，特異性為91.1%。

圖1 AQP4抗體檢測陽性(×60)Fig.1 AQP4 antibody test positive(×60)

表1 NMO-IgG檢測方法對臨床診斷的NMO及非NMO患者的四格表Tab.1 The 4 case table of NMO-IgG detection methods to NMO and not NMO patients

圖2 AQP4抗體檢測陰性(×60)Fig.2 AQP4 antibody test negative(×60)

3 討論

AQP家族是近幾年來逐漸被發(fā)現(xiàn)并認(rèn)識的一類水特異性膜內(nèi)在蛋白，在哺乳動物組織中已發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白(AQP0～AQP12)[7]。迄今已在腦內(nèi)已發(fā)現(xiàn)7 種AQP，分別是 AQP1、3、4、5、8、9、11，其中水通道蛋白4(AQP4)為主要在腦組織中表達(dá)的水通道蛋白。AQP4是中樞系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)最早的水通道蛋白，廣泛分布于中樞膠質(zhì)界膜、室管膜、海馬齒狀回、下丘腦的視上核和室旁核和腦表面的軟腦膜、小腦Purkinje細(xì)胞、腦微血管的細(xì)胞表面。它是膠質(zhì)細(xì)胞與腦脊液以及血管間的水調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[8]。

2004年NMO特異性水通道蛋白4抗體(AQP4-Ab)的發(fā)現(xiàn)，更加支持NMO是一種有別于MS的自身免疫性水通道病，NMO與MS治療及預(yù)后存在很大不同:在治療方面，NMO主張以免疫抑制劑治療為主[如:硫唑嘌呤(AZP)、米托蔥醒(Mix)、靜脈丙種球蛋白(IVIg)][9，10]。而 MS 則多主張以免疫調(diào)節(jié)治療為主[如:干擾素(IFN)、醋酸格拉太咪爾(GA)][11]。預(yù)后方面，NMO 因?yàn)榇嬖谳^高的死亡率及嚴(yán)重病殘率，故預(yù)后比MS差。因此對于NMO的鑒別診斷對其進(jìn)行合理治療是很有必要的。疾病是否處于活動期及大劑量激素治療等對血清抗體滴度有一定影響，因此對抗體檢測結(jié)果也有一定影響，本組NMO患者有一例血清抗體檢測結(jié)果為陰性，查其血樣標(biāo)本留取時間是在使用激素治療后1周。且本組MS病人有2例及1例急性脊髓炎患者及1例腦脊髓炎患者檢測結(jié)果為陽性，此例急性脊髓炎患者2月后再次復(fù)發(fā)而診斷為NMO，對NMO-IgG抗體檢測結(jié)果為陽性者給予高度重視，觀查其臨床表現(xiàn)及復(fù)發(fā)情況等。

目前抗體NMO-IgG的血清學(xué)檢測陽性已成為NMO最新診斷標(biāo)準(zhǔn)的支持條件之一[4]。對于本組研究結(jié)果顯示，采用間接免疫熒光法初步檢測到我院神經(jīng)內(nèi)科收住的患者2010年7月～2011年10月期間NMO患者血清NMO-IgG，其診斷NMO的靈敏度為88.9%，特異度91.1%。這與國外相關(guān)報道NMO-IgG抗體檢測在診斷NMO上具有高度靈敏性及特異性相近，提示NMO-IgG可作為國內(nèi)NMO診斷的重要生物學(xué)指標(biāo)。由于本項(xiàng)NMO-IgG檢測僅是一種較粗糙的抗體定性檢測方法。該方法仍待改進(jìn)以提高抗體檢測的靈敏度。且本組實(shí)驗(yàn)測定患者血清標(biāo)本量較小，但也能說明本實(shí)驗(yàn)方法是可取的，采取更精細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及大量的血清標(biāo)本檢測為臨床診斷提供更準(zhǔn)確的參考標(biāo)準(zhǔn)是以后的發(fā)展方向，尤其是如果有更為便捷的試劑盒檢測，為NMO-IgG抗體的測定提供更為方便且客觀標(biāo)準(zhǔn)的檢測平臺，如對NMO-IgG抗體進(jìn)行定量檢測，分析一定范圍的抗體量對于疾病處于某段時期的意義及臨床指導(dǎo)作用，將對NMO疾病的攻破有著更為深遠(yuǎn)的意義。因本實(shí)驗(yàn)用到小鼠腦組織，對于取材時的細(xì)微差異、血樣標(biāo)本留取時間的差異如入院未能及時留取標(biāo)本及觀測結(jié)果對于觀察者來說有一定的主觀性等多方面因素的存在，因此檢測結(jié)果的客觀性不夠強(qiáng)，但是綜合整個實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果的確有一定的意義。

在2007年 Takahashi等[12]為代表的采用人AQP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測抗人AQP4抗體，這種方法較2004年Lennon等NMO-IgG檢測方法敏感性更高。當(dāng)血清抗體滴度較低時用Lennon等所采用NMOIgG檢測方法檢測結(jié)果可能為陰性，但采用人AQP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測法則會是陽性結(jié)果。文獻(xiàn)表明，運(yùn)用人AQP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為間接免疫熒光測定的酶作用底物，抗AQP4抗體測定對NMO的敏感性分別是91%，特異性是100%[11]?？贵w測定的方法仍在提高其準(zhǔn)確性及為臨床帶來的便易及實(shí)用性，我們期待NMO-IgG的測定有更美好的未來，同時對于AQP4作為NMO自身免疫反應(yīng)攻擊的靶點(diǎn)，使NMO的免疫和病理研究進(jìn)入了一個新的階段，給NMO的治療提供了新思路，或許將來AQP4可能成為NMO藥物治療的作用靶點(diǎn)，阻斷NMO的免疫進(jìn)程，為NMO的治療開啟一個新的領(lǐng)域。

1 Devic C.Myelite subaigue compliquee de nevrite optique[J].Bull Med，1894;35:18-30.

2 Lennon V A，Wingerchuk D M，Kryzer T J et al.Aserum autoantibody markerof neuromyelitis optica[J].Lancet，2004;364:2106-2112.

3 Weinshenker B G，Lennon V A，Wingerchuk D M et al.The spectrum of neuromyelitis optica[J].Lancet Neurology，2007;6(9):805-815.

4 Wingerchuk D M，Lennon V A，Pittock S J et al.Revised diagnostic criteria for neuromyelitis optica[J].Neurology，2006;66(10):1485-1489.

5 McDonald W I，Compston A，Edan G et al.Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis:guidelines from the International Panel on the diagnosis of multiple sclerosis[J].Ann Neurol，2001;50(1):121-127.

6 王維治.神經(jīng)病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:265-265.

7 Zelenina M，Zelenin S，Aperia A.Water channels(aquaporins)and their role for postnatal adaptation[J].Pediat Res，2005;57(5 Pt2):47R-53R.

8 楊文茜，潘冰冰，王云姣 et al.水通道蛋白4的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2009;4(20):238-241.

9 Weinshenker B G，O'Brien P C，Petterson T M et al.A randomized trial of plasma exchange in acute central nervous system inflammatory demyelinating disease[J].Ann Neurol，1999;46(6):878-886.

10 Watanabe S，Nakashima I，Misu T et al.Therapeutic efficacy of plasma exchange in NMO-IgG positive patients with neuromyelitis optica[J].Mult Scler，2007;13(1):128-132.

11 Chen M，Gran B，Costello K et al.Glatiramer acetate in duces a Th2-biased response and crossreactivity with myelin basic protein in patients with MS[J].Mult Scler，2001;7(4):209-219.

12 Takahashi T，F(xiàn)ujihara K，Nakashima I et al.Anti-aquaporin-4 antibody is involved in the pathogenesis of NMO:a study on antibody titre[J].Brain，2007;130(5):1235-1243.