反復(fù)腹痛患兒及家庭成員中幽門螺桿菌感染和外周血淋巴細胞亞群變化的研究①

黃永琴 劉 梅 曹 佳 馬麗菊 黃永坤 戚 勤 周麗芳

(云南省昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，昆明650032)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種螺旋狀、微需氧革蘭陰性桿菌，主要定植于人胃粘膜，長期與人類宿主共生。具有很強的感染性，全球仍有一半的人口感染Hp[1]。發(fā)展中國家感染率較高，兒童感染率超過成人。Hp被公認為是慢性胃炎、消化性潰瘍的致病因素，也與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。但Hp感染的致病機制仍不是很清楚，除本身的動力裝置、粘附特性以及各種毒力因子引起粘膜損傷致病外，宿主免疫功能異常亦是Hp致病的重要機制。本研究以家庭為單位，對11個家庭反復(fù)腹痛患兒及家庭成員50名及55名正常對照行外周血淋巴細胞亞群 CD3+(%)、CD19+(%)、CD4+(%)、CD8+(%)、CD16+56(%)、CD4+/CD8+檢測，以了解幽門螺桿菌感染反復(fù)腹痛患兒及家庭成員外周血淋巴細胞亞群的變化。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇3歲至14歲因反復(fù)腹痛半年以上來我科就診的患兒及其一級和二級親屬列為研究對象，其標準:①在云南出生且生活3年以上;②無嚴重的心、肺、腦、腎、皮膚、營養(yǎng)、內(nèi)分泌疾病及免疫缺陷病;③近4周內(nèi)無服用抗生素、鉍劑、質(zhì)子泵阻滯劑和激素史。共有11個家庭50名成員符合條件。55名志愿者(包括來醫(yī)院體檢中心進行體檢的健康者和在校大學(xué)生)所有研究對象必須身體健康。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 征得患兒父母和家庭其他成員知情同意，采用EDTA抗凝管抽取3 ml靜脈血，2 ml提取血漿行Hp抗體及分型檢測。1 ml行淋巴細胞亞群檢測。

1.2.2 實驗材料 ①Hp免疫印跡試劑盒 (試劑由深圳市伯勞特生物制品有限公司提供，批號:101126)。每個試劑盒包括兩瓶25 ml濃縮洗滌液(主要成分磷酸鹽緩沖液)、一瓶25 ml酶聯(lián)試劑(主要成分過氧化物酶標記羊抗人IgG)、一瓶25 ml顯色劑A(主要成分3，3一二氨基聯(lián)苯氨)、一瓶25 ml顯色劑B(主要成分H2O2)、一瓶25 ml終止液(主要成分H2SO4)、8條Hp抗原印跡薄膜和一張標準帶。②淋巴細胞亞群檢測試劑盒 BD SimultestTMIMK-lymphocyte(試劑由美國Becton Dickinson公司提供，批號:340182)

1.2.3 檢測方法 ①Hp免疫印跡檢測:按試劑盒說明書進行操作，檢測Hp空泡毒素(CagA)、毒素相關(guān)蛋白抗體(VacA)、尿素酶A及B抗體(UreA、UreB)。當CagA抗體(+)和/或VacA抗體(+)陽性時，為Ⅰ型Hp感染;僅出現(xiàn)Ureas抗體(+)，為Ⅱ型Hp感染。三種抗體陰性即為Hp抗體陰性。Hp陰性者選為正常對照組。②外周血淋巴細胞亞群直接免疫熒光染色:在6個流式檢測管中分別加入 CD45-FITC/CD14-PE、CD3-FITC/CD19-PE、CD3-FITC/CD4-PE、CD3-FITC/CD8-PE、CD3-FITC/CD(16+56)-PE和陰性對照(IgG1-FITC/IgG2a-PE)各20 μl及 EDTA抗凝全血100 μl，室溫避光孵育20分鐘;加入溶血素2 ml作用10分鐘;離心洗滌后加入500 μl PBS緩沖液混勻后行流式細胞儀(FCM)分析。③FCM分析:美國Becton Dickinson公司流式細胞儀(FACScalibur)，激發(fā)光源FITC(530/30)nm，PE(585/42)nm，應(yīng)用 SimulSET軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.4 Hp感染的診斷標準和分組 根據(jù)2007年8月10～12日在江西廬山召開的第三次全國Hp共識會議提出的幽門螺桿菌診斷標準[2]。11個家庭50名成員及55名志愿者中通過檢測幽門螺桿菌抗體和分型，選取幽門螺桿菌陰性者作為正常對照組。根據(jù)癥狀將研究對象分為腹痛組和正常對照組。另外再根據(jù)癥狀及年齡將研究對象分為腹痛患兒組、腹痛成人組及正常對照組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，計量資料均進行正態(tài)性檢驗，各指標以±s表示，偏態(tài)分布及方差不齊采用秩和檢驗，三組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用SNK(q檢驗)，另外兩組間比較采用t檢驗，以α=0.05為統(tǒng)計標準，當P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp感染腹痛組和正常對照組淋巴細胞亞群結(jié)果(見表1) CD19+在三組間的值呈偏態(tài)分布和方差不齊采用秩和檢驗，其余為近似正態(tài)分布采用t檢驗。腹痛組外周血CD19+(%)較正常對照組增加(χ2=4.344，P=0.037)，腹痛組外周血 CD8+(%)顯著降低(t=-3.573，P=0.001)，腹痛組外周血CD4+/CD8+比值高于正常對照組(t=2.327，P=0.023)，另外兩組間比較外周血 CD3+(%)、CD4+(%)、CD16+56(%)均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 Hp感染腹痛組及正常對照組外周血淋巴細胞亞群檢測結(jié)果(%，±s)Tab.1 Peripheral blood lymphocyte subset between abdominal pain group with Hp infection and control group(%，±s)

表1 Hp感染腹痛組及正常對照組外周血淋巴細胞亞群檢測結(jié)果(%，±s)Tab.1 Peripheral blood lymphocyte subset between abdominal pain group with Hp infection and control group(%，±s)

Th/Ts Abdominal pain 46 65.74±7.95 13.48±5.21 34.4 Group n CD3+ CD19+ CD4+ CD8+ CD16+56 8±7.09 26.48±6.24 19.33±7.54 1.38±0.46 Control 34 69.09±7.23 12.29±9.67 34.29±6.12 31.68±6.69 19.38±7.32 1.16±0.35 t value -1.963 4.344 0.122 -3.573 -0.033 2.327 P value 0.053 0.037 0.904 0.001 0.973 0.023

表2 Hp感染腹痛患兒、成人及正常對照組外周血淋巴細胞亞群檢測結(jié)果(%，±s)Tab.2 Peripheral blood lymphocyte subset among children's and adult's abdominal pain group with Hp infection(%，±s)

表2 Hp感染腹痛患兒、成人及正常對照組外周血淋巴細胞亞群檢測結(jié)果(%，±s)Tab.2 Peripheral blood lymphocyte subset among children's and adult's abdominal pain group with Hp infection(%，±s)

Th/Ts Child abdominal pain 11 65.45±8.37 16.55±5.89 32.09±4.85 27.64±5.77 16.18±6.68 1.20±0.26 Group n CD3+ CD19+ CD4+ CD8+ CD16+56 Adult's abdominal pain 35 65.83±7.94 12.51±4.65 35.23±7.56 26.11±6.41 20.31±7.61 1.43±0.50 Control 34 69.09±7.23 12.29±9.67 34.29±6.12 31.68±6.69 19.38±7.32 1.16±0.35 F value 1.858 8.989 0.936 6.574 1.316 4.109 P value 0.163 0.011 0.397 0.002 0.274 0.02

2.2 Hp感染腹痛患兒、成人及正常對照組外周血淋巴細胞亞群檢測結(jié)果(見表2) CD19+在三組間的值呈偏態(tài)分布和方差不齊采用秩和檢驗，其余為近似正態(tài)分布用采用單因素方差分析。腹痛患兒組CD19+(%)較腹痛成人組及正常對照組顯著增加(χ2=8.989，P=0.011)，腹痛成人組與正常對照組間兩兩比較無統(tǒng)計學(xué)意義。腹痛患兒組及腹痛成人組外周血CD8+(%)較正常對照組均顯著降低(F=6.574，P=0.002)，但腹痛患兒組與腹痛成人組兩兩比較，外周血CD8+(%)無統(tǒng)計學(xué)意義。腹痛成人組外周血CD4+/CD8+比值高于正常對照組及腹痛患兒組(F=4.109，P=0.020)，但腹痛患兒組與正常對照組間兩兩比較無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

Hp感染患者的胃粘膜中存在大量B細胞，同時檢測到高滴度的IgG、IgM和IgA。在患者活檢組織中，亦能觀察到抗體包被細菌的現(xiàn)象，均提示存在活動性體液免疫反應(yīng)。目前認為Hp誘導(dǎo)宿主B細胞免疫應(yīng)答的途徑包括Hp可溶性產(chǎn)物的被動吸收、上皮細胞直接內(nèi)吞細菌抗原、抗原通過被破壞的胃上皮進入組織激發(fā)機體免疫應(yīng)答[3]。本研究中反復(fù)腹痛組外周血CD19+比正常對照組增加明顯，且反復(fù)腹痛患兒外周血CD19+比反復(fù)腹痛成人組增加，說明Hp感染宿主致病時外周血B細胞增加，患兒組增加更明顯，B細胞免疫反應(yīng)活躍，這提示機體體液免疫反應(yīng)在Hp致病性中發(fā)揮著作用。

Hp感染時胃上皮細胞可呈遞抗原，起到非專職性抗原呈遞細胞的作用，進而介導(dǎo)免疫反應(yīng)。宿主出現(xiàn)抗原特異性T細胞，主要是由于CD4+T輔助細胞在固有層內(nèi)積聚。研究表明慢性活動性胃炎與CD4+/CD8+T細胞比例升高相關(guān)[4]。本研究11個家庭反復(fù)腹痛患兒及家庭成員46名Hp感染患者外周血CD3+、CD4+T淋巴細胞無明顯變化。CD8+T淋巴細胞明顯降低。CD4+/CD8+比值明顯升高與文獻相符，可能因粘膜局部淋巴細胞浸潤增加，則外周血中能檢測的淋巴細胞減少。本研究顯示抑制性T淋巴細胞數(shù)量減少，輔助性T淋巴細胞數(shù)量相對增多，導(dǎo)致輔助性T淋巴細胞功能相對亢進，抑制性T淋巴細胞功能相對不足，使T淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)失衡，引起細胞免疫損傷;同時導(dǎo)致B淋巴細胞功能亢迸，產(chǎn)生大量自身抗體，進一步損傷機體。另外輔助性T淋巴細胞功能相對亢進，可引起輔助性T細胞Th1型和Th2型應(yīng)答，可表現(xiàn)為Th1在胃粘膜內(nèi)發(fā)揮宿主免疫應(yīng)答并分泌炎性介質(zhì)白細胞介素(Interleukin，IL)12、IL-18、腫瘤壞死因子 α和干擾素γ等細胞因子;Th2細胞參與粘膜表面的分泌性免疫應(yīng)答和過敏反應(yīng)，分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細胞因子，參與本類疾病的發(fā)病過程。

自然殺傷細胞(Natural killer cells，NK cells)的殺傷活性無MHC限制，不依賴抗體，因此稱為自然殺傷活性，NK細胞是不同于T、B淋巴細胞具有直接殺傷靶細胞效應(yīng)的特殊淋巴細胞。NK細胞作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可以在無預(yù)先活化的情況下對病原體的入侵作出快速廣泛的應(yīng)答，殺傷靶細胞并釋放細胞因子，尤其是IFN-γ。NK細胞的效應(yīng)功能受宿主或病原體的調(diào)控，可以由NK細胞表面活化性受體與宿主或病原體細胞表面配體的結(jié)合而啟動[5]。NK細胞也會對其它信號作出應(yīng)答，尤其是抗原提呈細胞分泌的細胞因子，誘導(dǎo)NK細胞對病原體的入侵發(fā)揮早期的宿主應(yīng)答[6]。本研究中11個家庭46名成員反復(fù)腹痛組外周血NK細胞與正常對照無差異，可能因Hp感染為慢性感染，NK細胞發(fā)揮作用在感染的早期有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)在同一家族家庭成員中有的Hp感染患病，有的被感染而未患病，而同一家族家庭成員的生活方式和所處的環(huán)境基本相同，卻出現(xiàn)不同結(jié)果。說明Hp感染致病性與宿主的自身免疫遺傳因素不同有密切關(guān)系。另外，本研究中發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細胞明顯降低，且CD4+/CD8+比值明顯升高，基于Hp的慢性感染可通過B細胞激活并誘導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生而致自身免疫紊亂[7]。這提示Hp感染致病性與宿主的自身免疫遺傳因素有密切關(guān)系。

總之，Hp感染反復(fù)腹痛患兒及家庭成員外周血淋巴細胞亞群存在明顯異常，B細胞免疫應(yīng)答及T細胞免疫應(yīng)答均較活躍，可能與疾病的進展及不同結(jié)局有關(guān)。本研究提示外周血淋巴細胞亞群異常與Hp感染后的致病性相互間是有影響和內(nèi)在聯(lián)系的。

1 Correa P，Piazuelo M B.Natural history of Helicobacter pylori infection[J].Dig Liver Dis，2008;40(7):490-496.

2 中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會.第三次全國幽門螺桿菌感染若干問題共識報告[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2008;88(10):652-656.

3 Baldari C T，Lanzavecchia A，Telford J L.Immune subversion by Helicobacter pylori[J].Trends Immunol，2005;26(4):199-207.

4 Krenska-Wiacek A，Szaflarska-Szczepanik A，Wysocki M.Flow cytometric analysis of peripheral blood lymphocytes in children with chronic gastroduodenitis with and without Helicobacter pylori infection[J].Pol Merkur Lekarski，2002;13(74):107-110.

5 Arase H ，Mocarski E S，Campbell A E et al.Direct recognition of cytomegalovirus by activating and inhibitory NK cell receptors[J].Science，2002;296(5571):1323-1326.

6 Moretta L，F(xiàn)erlazzo G，Bottino C et al.Effector and regulatory events during natural killer-dendritic cell interactions[J].Immunol Rev，2006;214:219-228.

7 Yamanishi S，Iizumi T，Watanabe E et al.Implications for induction of autoimmunity via activation of B-1 cells by Helicobacter pylori urease[J].Infect Immun，2006;74(1):248-256.