骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎MMP-2及MMP-9 mRNA表達(dá)的影響①

牛廣華 高玉潔 高明利 郭 鶴 王柏山 (遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng) 110032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthrits，RA)作為一種發(fā)病機(jī)理不同，治療效果不佳，致殘率很高的自身免疫性疾病，至今無(wú)滿意的治療藥物，傳統(tǒng)的慢作用抗風(fēng)濕藥副作用大，患者耐受性差，新型的生物制劑費(fèi)用昂貴，不能口服，體內(nèi)清除快，靶向性差，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療從理論上可克服以上缺陷，是一種新的非常有前途的治療手段。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，具有自我更新、高度增殖及多向分化的能力。隨著對(duì)BMSCs研究的不斷深入，BMSCs自體或異體骨髓移植已經(jīng)證實(shí)在治療自身免疫病中有確切的療效，并已成為治療自身免疫病的一種新的趨勢(shì)。

基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)在RA關(guān)節(jié)骨及軟骨的破壞中發(fā)揮重要作用[1]。RA患者滑液及滑膜細(xì)胞均有MMPs的高表達(dá)[2]。MMP-2、MMP-9與RA的病情嚴(yán)重程度及關(guān)節(jié)破壞相關(guān)，MMP-2、MMP-9是明膠酶，其作用的底物是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成成分。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，MMP-2、MMP-9與RA的病情嚴(yán)重程度及關(guān)節(jié)破壞相關(guān)。

為此本項(xiàng)目通過(guò)BMSCs移植治療小鼠Ⅱ型膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)的實(shí)驗(yàn)研究，觀察BMSCs治療膠原鼠組織中MMP-2及MMP-9表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討B(tài)MSCs影響MMP表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制，為BMSCs治療人類RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及藥物 ①牛Ⅱ型膠原(collagen from bovine nasal septutm，C7809，5 mg，Sigma 公司);②弗氏完全佐劑(Fveunds complete adjuvant，098K8729-CAS 9007-81-2，10 ml，Sigma公司);③流式細(xì)胞儀抗體 PE-CD34，F(xiàn)ITC標(biāo)記的小鼠抗體(Pharmingen公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSCs的體外分離和表型鑒定 ①以健康C57BL/6(H-2b)小鼠為供體，股骨、脛骨離斷，自骨髓腔內(nèi)獲取骨髓標(biāo)本，收集骨髓標(biāo)本5份，按2∶1的比例加入Ficoll-Hypaque分離液(密度1.077)中，并采用梯度密度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用PBS液洗滌3～4遍，用1 ml生理鹽水重懸。②干細(xì)胞分選:應(yīng)用美國(guó)BD公司FAcscaliburTM型分選式細(xì)胞分析儀;進(jìn)行骨髓的 CD44+細(xì)胞分選。收集分選的CD44+陽(yáng)性細(xì)胞，PBS充分洗滌后，以生理鹽水重懸，并調(diào)整成濃度為2×106ml-1的細(xì)胞懸液。處理完畢的采集物通過(guò)低溫凍存以備回輸。③BMSCs鑒定:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面抗原，BMSCs高表達(dá) CD29、CD44、CD71，而 CD34、CD45 陰性。分別取100 μl細(xì)胞與抗鼠 CD45、CD44、CD105、CD71 抗體在室溫下充分反應(yīng)30分鐘，用PBS洗滌2次，重懸于PBS液中，流式細(xì)胞儀測(cè)定其表型。確定所分離的BMSCs的純度(具體操作按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，用system 11軟件分析結(jié)果。每個(gè)樣本至少分析10 000個(gè)細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 近交系C57BL/6(H-2b)小鼠40只，動(dòng)物年齡45～50天，體重(17±3)克，隨機(jī)分為:正常對(duì)照組、模型組、甲氨喋呤治療陽(yáng)性對(duì)照組、BMSCs移植治療組，每組10只小鼠。

1.2.3 建立CIA動(dòng)物模型 除正常組外，寒冷刺激10天后，將10 mg牛Ⅱ型膠原(BⅡC)與5 ml弗氏完全佐劑研磨后，以每只100 μl于小鼠背部、踝部、尾根部皮內(nèi)注射免疫，免疫注射14天按上述方法少量再次腹腔內(nèi)注射，作為激發(fā)注射免疫。之后對(duì)各組大鼠的發(fā)病情況進(jìn)行觀察。主要為關(guān)節(jié)水腫，皮膚紅斑及關(guān)節(jié)活動(dòng)情況等。第15天開(kāi)始移植治療，于42天對(duì)各組小鼠的膝及肘以下關(guān)節(jié)進(jìn)行組織病理學(xué)分析。

1.2.4 BMSCs(輸注)途徑及劑量 均采用尾靜脈注射途徑:CIA小鼠二次免疫接種后第2天，除模型組、正常對(duì)照組用生理鹽水，余以2×106細(xì)胞數(shù)/kg體重的密度將BMSCs注入小鼠尾靜脈內(nèi)。

1.2.5 甲氨喋呤(輸注)途徑及劑量 采用每次甲氨蝶呤0.017 5 g/kg對(duì)甲氨喋呤陽(yáng)性治療對(duì)照組小鼠進(jìn)行灌胃，每5天一次，直到實(shí)驗(yàn)倒數(shù)第2天。42天后將小鼠處死取材。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心、遼寧中醫(yī)藥大學(xué)病理技術(shù)實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 MMP-2、MMP-9 mRNA 檢測(cè)

1.3.1 取材方法 停藥后處死小鼠，解剖取腫瘤組織，完整剝離后稱重，取脾組織1 cm×0.15 cm×0.15 cm，放入凍存管，迅速投入液氮罐，用以檢測(cè)MMP-2、MMP-9 mRNA。

1.3.2 RNA提取 采用Trizol一步法RNA提取試劑盒提取脾組織總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值(OD)值，并用電泳法鑒定分子完整性。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用逆轉(zhuǎn)錄酶鏈反應(yīng)(RTPCR)方法。

1.3.4 PCR 擴(kuò)增 10×Buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl23 μl，2.5 mmol/L，dNTP 4 μl，引物各 1 μl，cDNA 10 μl，Taq 酶0.15 μl，加雙蒸水后總體積達(dá)50 μl，振蕩混勻。循環(huán)條件:94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，30個(gè)循環(huán);72℃后延伸7分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物在112%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，以凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，用MMP-2、MMP-9與β-actin比值表示其相對(duì)表達(dá)水平。MMP-2引物序列:上游5'-ATGCGGAAGCCAAGATGTG-3'，下游 5'-GTCCAGGTCAGGTGTGTAAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度126 bp;MMP-9引物序列:上游 5'-TGAGTCCGGCAGACAATCC-3'，下游5'-CCTTATCCACGCGAATGACG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度432 bp;β-actin引物序列:G1:5'ACCACCATGGAGAAGGCTGG 3';G2:5'CTCAGTGTAGCCCAG-GATGC 3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度528 bp。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量鑒定 所提組織總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定:OD260/OD280在1.8～2.0之間，經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，獲得了兩條較清晰的電泳帶，18S和28S，其中28S的量約為18S的兩倍，證實(shí)RNA的完整性(圖1)

2.2 各組MMP-2 mRNA表達(dá)水平的影響 MMP-2 mRNA的RT-PCR分析凝膠電泳結(jié)果顯示，在126 bp處呈現(xiàn)出一特異性條帶(見(jiàn)圖2)。以528 bp βactin擴(kuò)增產(chǎn)物作為內(nèi)參照進(jìn)行半定量分析(圖2、表1)，由表可見(jiàn)CIA鼠模型組脾組織表達(dá)的MMP-2 mRNA明顯高于正常對(duì)照組、甲氨蝶呤治療組、BMSCs移植治療組(P＜0.05);而B(niǎo)MSCs移植治療組與甲氨蝶呤治療組有顯著性差異(P＜0.05)，與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 各組MMP-9 mRNA表達(dá)水平的影響 MMP-9 mRNA的RT-PCR分析凝膠電泳結(jié)果顯示，在432 bp處呈現(xiàn)出一特異性條帶(見(jiàn)圖3)。以528 bp βactin擴(kuò)增產(chǎn)物作為內(nèi)參照進(jìn)行半定量分析(圖3、表1)，由表可見(jiàn)CIA模型組脾組織表達(dá)的MMP-9 mRNA明顯高與正常對(duì)照組、甲氨蝶呤治療組、BMSCs移植治療組(P＜0.05);而B(niǎo)MSCs移植治療組與甲氨蝶呤治療組有顯著性差異(P＜0.05)，與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 RNA質(zhì)量鑒定Fig.1 RNA quality identification

2.4 各組灰度值的比較 β-actin灰度值結(jié)果顯示(見(jiàn)表1):BMSCs移植治療組與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);CIA模型組小鼠與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);甲氨蝶呤治療組與CIA模型組小鼠比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);而B(niǎo)MSCs移植治療組與甲氨蝶呤治療組有顯著性差異(P＜0.05)。

圖2 各組組織中MMP-2 mRNA的表達(dá)結(jié)果Fig.2 The expression of MMP-2 mRNA in each organization

圖3 各組組織中MMP-9 mRNA的表達(dá)結(jié)果Fig.3 The expression of MMP-9 mRNA in each organization

表1 各基因組灰度值比β-actin灰度值(μmol/L)Tab.1 The ratio of gray value genome and β-actin(μmol/L)

3 討論

MMPs是一類含有鋅原子，其活性依賴于鈣原子的肽鏈內(nèi)切酶，大都以潛酶形式分泌。MMP-2和MMP-9是其中一大類，又名明膠酶，相對(duì)分子質(zhì)量分別為72 000、95 000。由于其是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)降解最重要的酶系統(tǒng)，參與EMC的重塑、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等[1]，近幾年成為研究熱點(diǎn)。

MMPs對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)EMC的降解是RA患者關(guān)節(jié)破壞的必要環(huán)節(jié)[2，3]。近年發(fā)現(xiàn)RA患者的滑液及外周血中 MMP-2，MMP-9 水平均增高[4，5]。Uchibori等[6]對(duì)關(guān)節(jié)炎模型小鼠研究也證明 MMP-2、MMP-9在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起一定作用。我們的測(cè)定表明，RA患者血清中MMP-2、MMP-9水平顯著高于健康對(duì)照，提示血清MMP-2、MMP-9水平與RA病情活動(dòng)相關(guān)，在RA的骨破壞中可能起作用。Makowski等[7]揭示MMP-9與抗-雙鏈DNA呈負(fù)相關(guān)，在抗體沉積在組織期間，對(duì)監(jiān)測(cè)SLE疾病的活動(dòng)非常重要。Derosa等[8]發(fā)現(xiàn)酶譜分析是檢查MMPs水平的精確方法，當(dāng)MMPs的量高于400 pg，其活性才能被檢測(cè)，其表達(dá)量與其活性的比率為7∶1。因此，該實(shí)驗(yàn)不僅用于定量檢測(cè)酶的總量，而且還可檢測(cè)酶量與活性的比例，這使得酶譜不同于 ELISA，ELISA不能分辨酶的活性和非活性形式[9]。而酶譜結(jié)果能夠反映研究對(duì)象的MMPs活性，通過(guò)研究MMPs的表達(dá)水平和活性，MMPs在RA和SLE中作用能較清楚地反映出來(lái)。在正常的人體組織中，MMPs的表達(dá)較低，但在一定的病理過(guò)程中其表達(dá)水平可升高。細(xì)胞外信號(hào)，包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和直接的細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸能瞬時(shí)刺激MMPs蛋白的合成[1]。SLE是一種自身免疫性疾病，其特征是以Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)為主，而RA則是以Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)為主。鑒定為什么這兩種不同免疫反應(yīng)的患者血清中MMP-2和MMP-9顯著增加的機(jī)制是非常有意義的。一種可能的解釋是:不管在RA或SLE中，免疫反應(yīng)過(guò)程中核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)組成式激活，上調(diào)各種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄活性，提高炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子接著刺激MMPs的表達(dá)和活性[1]。但是，這種解釋需要進(jìn)一步研究。總之，RA和SLE患者血清中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平和活性顯著升高，因此MMPs蛋白在自身免疫性疾病中起一定的作用，可作為該類疾病的一種輔助檢測(cè)指標(biāo)。

本研究通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)和凝膠圖像分析結(jié)果顯示在CIA小鼠脾組織中MMP-2和MMP-9的表達(dá)明顯增加。這點(diǎn)與別的文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。而經(jīng)過(guò)BMSCs移植治療后MMP-2和MMP-9的表達(dá)明顯下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異(P＜0.05)，從而證明BMSCs對(duì)CIA小鼠移植治療后MMP-2和MMP-9有免疫調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明BMSCs可以通過(guò)調(diào)控MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)，參與RA軟骨的病理變化過(guò)程及軟骨ECM的合成，維持軟骨ECM中膠原纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)架，可有效地治療RA，并改善其臨床癥狀，是一種很有前途的生物治療方法。

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