Rab7基因沉默對LPS活化的巨噬細胞中NO/iNOS的影響①

劉 帥 謝基明 王玉珍 宋 亮 王 娜 李云旭 孫曉琳

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS) ，是 G-菌的主要致病成分，巨噬細胞受到 LPS刺激時，可激活細胞內(nèi)p38絲裂原激活的蛋白激酶，并促使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等的表達，催化產(chǎn)生大量NO，參與炎癥反應(yīng)[1，2]。

NO是體內(nèi)L-精氨酸(L-arginine)在一氧化氮合酶作用下產(chǎn)生的一種結(jié)構(gòu)簡單的小分子氣體化合物，它具有十分重要的生理功能。在人體內(nèi)，NO的作用主要包括兩個方面:一是信號分子作用;二是具有細胞毒性作用，NO直接或間接地作用于細胞膜、染色體及其他細胞內(nèi)成分，引起細胞死亡或癌變的過程。此外，NO形成的自由基還能作用于細胞外基質(zhì)，引起細胞外基質(zhì)成分的改變，進而調(diào)節(jié)血管生成[3]。

一氧化氮合酶作為NO合成的關(guān)鍵酶，其表達直接影響NO的生成。一氧化氮合酶家族有3種亞型:誘導(dǎo)型(inducible NOS，iNOS)，神經(jīng)型(neural NOS，nNOS) 及內(nèi)皮型(endothelial NOS，eNOS)。其中，iNOS通常在炎癥或腫瘤等病理條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生，為Ca2+非依賴性，在細胞因子及其他細胞毒性物質(zhì)的作用下產(chǎn)生大量的NO，加重炎性反應(yīng)過程或產(chǎn)生致癌作用[3]。

Rab7是Rabs(Ras related proteins in brain)蛋白的一個成員，是一種單體形式的 GTP結(jié)合蛋白，能夠結(jié)合GTP并將GTP水解[4]。在囊泡形成、轉(zhuǎn)運、粘附、錨定、融合等不同的運輸階段調(diào)控囊泡的運輸。Rab7定位在晚期內(nèi)體并調(diào)節(jié)胞吞途徑的晚期環(huán)節(jié)，它與一些受體的轉(zhuǎn)運和溶酶體的降解有關(guān)，如血管緊張素1A受體、表皮生長因子受體、神經(jīng)生長因子受體TrkA[5-7]。Rab7還調(diào)控晚期內(nèi)體/溶酶體的聚集和融合，也是維持核周溶酶體結(jié)構(gòu)所必須的蛋白[8]。之前有研究證明 Rab7b參與TLRs信號通路且負向調(diào)控 TLRs信號通路[9]，鑒于 Rab7b與Rab7有50%的一致性和65%的相似性，我們推測Rab7和Rab7b可能有相似的功能。

siRNA是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的強大工具。siRNA是由21～23個堿基配對形成的雙鏈，其調(diào)控的機制是通過互補配對而沉默相應(yīng)靶位基因的表達，siRNA識別靶序列是有高度特異性的。

本實驗是通過在RAW264.7細胞中瞬時轉(zhuǎn)染靶向于 Rab7的 siRNA，分析 Rab7基因沉默后的RAW264.7細胞的生長特性，研究Rab7基因沉默后對LPS刺激的巨噬細胞中NO/iNOS表達的影響，本研究為進一步探索Rab7在調(diào)控TLRs信號通路中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑 小鼠巨噬細胞RAW264.7(購自北京協(xié)和細胞庫);胎牛血清(購自蘭州民海生物有限公司);DMEM培養(yǎng)基(Gibco，USA);MTT、LPS(均為 Sigma公司產(chǎn)品);TRIZOL、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、Real-time PCR mix(均為寶生物公司產(chǎn)品);FuGENE MD Transfection Reagent(購自羅氏公司);NO測定試劑盒(購自南京建成生物公司);Rab7抗體、actin抗體(均為Santa Cruz公司產(chǎn)品)。

1.2 siRNA的設(shè)計合成 從GenBank中查找小鼠Rab7基因的序列，根據(jù) siRNA的設(shè)計原則，利用Ambion公司提供的網(wǎng)上在線設(shè)計工具，設(shè)計出三對siRNA序列。經(jīng)Blast比對其特異性后，由上海吉瑪制藥有限公司合成。同時合成陰性對照N-siRNA。siRNA1:sense sequence:5'-CCAGUACAAAGCCACAAUAtt-3'，antisense sequence:5'-UAUUGUGGCUUUGUACUGGtt-3';siRNA2:sense sequence:5'-CAGAAGUGGAACUGUACAAtt-3'，antisense sequence:5'-UUGUACAGUUCCACUUCUGtt-3';siRNA3:sense sequence:5'-GUGGAACUGUACAAUGAAUtt-3'，antisense sequence:5'-AUUCAUUGUACAGUUCCACtt-3'。

1.3 RAW264.7的培養(yǎng)細胞及瞬時轉(zhuǎn)染 RAW264.7細胞株混懸后接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2天換液或傳代一次。將適量的RAW264.7細胞接種于相應(yīng)的細胞培養(yǎng)板(6孔板:5×105個/孔)細胞密度達到90%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時將siRNA與FuGENE MD Transfection Reagen混合，充分混勻，室溫靜置15分鐘，以形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物，隨后將復(fù)合物加入待轉(zhuǎn)染的細胞中，轉(zhuǎn)染后6～8小時換液。通過Real-time PCR和Western blot驗證相應(yīng)的干擾效果。

1.4 MTT法檢測基因沉默對RAW264.7細胞的影響 細胞計數(shù)，將 RAW264.7細胞以相同量(1×103個/孔)接種于96孔板，設(shè)3個復(fù)孔。5～6小時貼壁后血清饑餓12小時，轉(zhuǎn)染siRNA，開始計時，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24、48、72小時加入 MTT(0.5 mg/ml)，37℃、5%CO2培養(yǎng) 4小時，然后每孔加入150 μl DMSO，低速振蕩10秒，酶聯(lián)免疫檢測儀用OD570 nm檢測。

1.5 NO含量測定 細胞計數(shù)，將正常細胞以相同量(5×105)接種于6孔板，siRNA轉(zhuǎn)染后40小時，LPS刺激6小時和12小時，吸取上清，按照NO測定試劑盒測定NO含量。

1.6 總RNA提取及iNOS表達分析 TRIZOL法提取細胞的總 RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA完整性，并用RNA/DNA計算器對提取RNA進行定量。1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA。以5'-TGGAGCGAGTTGTGGATTGT-3'(sense)和5'-CTCTGCCTATCCGTC TCGTC-3'(antisense)作為 iNOS引物進行 RT-PCR和Real-time PCR。后者通過ABI 7300(Applied Biosystems，USA) 和 SYBR RT-PCR kit分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行分析，P＜0.05時認為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 基因沉默后Rab7的表達 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染一段陰性對照(N-siRNA)和三段干擾序列(S-1、S-2、S-3)到巨噬細胞中，通過Western blot方法檢測各段干擾序列的干擾效果，如圖1A所示，與無關(guān)干擾相比，S-3序列干擾后，Rab7的蛋白表達量明顯降低。我們又做了 Real-time PCR進一步驗證，如圖1B所示，S-3的干擾效果在50%。之后的實驗就確定用S-3序列作為干擾序列。

2.2 MTT檢測轉(zhuǎn)染細胞生長趨勢 我們隨后檢測了RAW264.7細胞中Rab7干擾后細胞的生長特性。從MTT測定的細胞生長趨勢(圖2)中可以看出，在Rab7干擾后48小時，RAW264.7的生長顯著加速，到72小時時仍高于對照。

2.3 Rab7基因沉默后對LPS刺激的巨噬細胞中iNOS/NO的影響 NO因參與殺滅微生物而且介導(dǎo)一系列病理生理反應(yīng)過程而日益受到人們的關(guān)注。我們通過檢測LPS刺激Rab7基因沉默的細胞不同時間的NO分泌量，初步分析Rab7在LPS/TLR4通路中的作用。Rab7基因沉默的巨噬細胞中，NO的含量隨著LPS刺激時間增加而增加，在LPS刺激后12小時，Rab7的沉默顯著促進了NO的生成(圖3)。

前面的實驗結(jié)果表明，Rab7基因沉默促進了LPS介導(dǎo)的NO的產(chǎn)生。我們進一步研究這種抑制作用是否通過抑制iNOS的活性導(dǎo)致。用LPS刺激Rab7基因沉默后的巨噬細胞不同時間，通過 RTPCR檢測iNOS的含量，發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，iNOS的表達量明顯增加，12小時達到最大值(圖4A)。

圖1 Rab7在siRNA干擾后的表達Fig．1 Rab7 expression after silencing

圖2 Rab7干擾后細胞的生長趨勢Fig．2 The growth trend of Rab7 silenced cells

圖3 NO含量測定Fig．3 NO determination

圖4 iNOS含量測定Fig.4 iNOS determination

Real-time PCR(圖4B)的結(jié)果顯示，Rab7沉默后顯著促進了LPS刺激的RAW264.7中iNOS的表達(P＜0.01)以上的實驗充分說明，Rab7基因沉默后促進了LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞NO/iNOS的表達。

3 討論

內(nèi)源性NO參與了體內(nèi)眾多生理、病理過程，包括免疫調(diào)節(jié)、松弛平滑肌、神經(jīng)遞質(zhì)及細胞毒作用等[10]。NO的生成過量與炎癥發(fā)生密切相關(guān)。Poly I:C、LPS、IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-12 及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等都能活化巨噬細胞，誘導(dǎo)iNOS表達及產(chǎn)生NO。NO是自由基性質(zhì)氣體，具有非?；顫姷幕瘜W(xué)性質(zhì)。正常情況下，NO維持時間長，具有重要的殺菌、抗病毒、殺傷腫瘤細胞等活性，但一旦失衡，就會導(dǎo)致體內(nèi)自由基濃度過高及一系列自由基反應(yīng)病理性加劇而誘發(fā)疾病。

通過NO和iNOS的含量測定表明Rab7基因沉默明顯促進了LPS介導(dǎo)的NO和iNOS的生成。之前有實驗結(jié)果表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Rab7過表達質(zhì)粒明顯抑制了LPS介導(dǎo)的NO和iNOS的生成，并且Rab7失活突變基因的表達阻斷了Rab7的抑制效應(yīng)[11]。由此我們再次確定Rab7基因負向調(diào)控NO和iNOS的生成而且依賴其GTP酶的活性。

瞬時轉(zhuǎn)染干擾RNA的成功為之后進一步研究Rab7對NO生成和Toll信號通路中的作用奠定基礎(chǔ)。同時，炎癥局部產(chǎn)生的多種細胞因子，可激活NO產(chǎn)生，NO又促進其中的多種細胞因子合成，進而引發(fā)瀑布式的炎癥反應(yīng)(Inflammatory cascade)，所以我們可推測Rab7基因的沉默會正向調(diào)控IFN-γ、TNF-α和白介素等炎性因子的表達，也可能正向調(diào)控TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1 Tinker A C，Wallace A V.Selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase:potentianents for the treatment of inflammatory diseases[J].Curr Top Med Chem，2006;6(2):77-92.

2 夏曉東，吳立琴，徐 慧et al.羅紅霉素通過誘導(dǎo)型一氧化氮合酶/一氧化氮途徑抑制哮喘大鼠氣道炎癥[J].中國藥理學(xué)通報，2009;25(9):1223-1236.

3 高 君.誘導(dǎo)型一氧化氮合酶與乳腺癌關(guān)系的研究進展[J].中國腫瘤，2007;16(12):991-993.

4 Hutagalung A H，Novick P J.Role of Rab GTPases in membrane traffic and cell physiology[J].Physiol Rev，2011;91(1):119-149.

5 Bucci C，Thimen P，Nicozizni P et al.Rab7:a key to lysosome biogenesis[J].Mol Biol Cell，2000;11:467-480.

6 Maximiliano G，Gutierrez，Daniela B et al.Rab7 is required for the normal progression of the autophagic pathway in mammalian cells[J].J Cell Sci，2007;117:2687-2697.

7 Wang Y，Chen T，Cao X et al.Lysosome associated small Rab GTPase Rab7b negatively regulates TLR4 signaling in macrophages by promoting lysosomal degradation of TLR4[J].Blood，2007;110(3):962-971.

8 Bingisser R M，Holt P G.Immuno-modulating mechanisms in the lower respiratory tract:nitric oxide mediated interactions between alveolar macrophages，epithelial cells and T-cells[J].Swiss Med Wkly，2001;131(13-14):171-179.

9 王寧飛，蔡富娟，劉 帥et al.過表達Rab7基因?qū)PS和Poly I:C活化的巨噬細胞RAW264.7中iNOS/NO的影響[J].中國免疫學(xué)雜志，2011;27(6):497-501.

10 Kawai T，Akira S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors[J].Nat Immunol，2010;11(5):373-384.

11 Manetti R，Annunziato F，Tomasevic L et al.Polyinosinic acid:polycytidylic acid promotes T helper type 1-specific immune responses by stimulating macrophage production of interferon-alpha and interleukin-12 Eur[J].Immunol，1995;25(9):2656-2660.