腎組織石蠟切片免疫熒光染色的新方法

張明超 鄭春霞 黃 倩 馬 怡 王偉偉 曾彩虹

免疫熒光檢查是腎活檢診斷必不可少的手段之一。然而，行免疫熒光檢查的冰凍組織常無腎小球，如何彌補(bǔ)這一缺憾，文獻(xiàn)有眾多方法。我們采用高溫高壓聯(lián)合酶修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，效果甚佳。

材料與方法

病例選擇 選擇在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所住院經(jīng)腎活檢明確診斷的患者50例。狼瘡瘡腎炎(LN，2例Ⅳ型，2例Ⅳ +Ⅴ型)、抗腎小球基膜(GBM)腎炎、致密物沉積病、輕鏈沉積病(κ)及淀粉樣變性(λ)各4例，感染后腎小球腎炎、膜性腎病及膜增生性腎小球腎炎各6例，IgA腎病12例。

方法 冰凍切片:冰凍組織切片(3μm)吹干，10%小牛血清封閉10 min，分別加DAKO公司異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔多克隆抗IgG(1∶200)、IgA(1∶100)、IgM(1∶50)、C3(1∶50)、C1q(1∶50)、κ(1∶100)、λ(1∶200)抗體，室溫孵育 40 min，流水沖洗，吹干，甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

石蠟切片:腎活檢組織經(jīng)10%甲醛固定，切取1.5μm的切片，用防脫片劑(多聚賴氨酸)處理過的載玻片進(jìn)行撈片，烤片。經(jīng)二甲苯充分脫蠟，100%～75%梯度酒精至水，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，將切片入EDTA緩沖液(pH8.0)，高溫高壓煮沸至噴氣，保溫2 min，自然冷卻后水洗，加胃蛋白酶(Invitrogen公司)室溫消化5 min，PBS洗，加10%小牛血清室溫孵育10 min，加DAKO公司兔多克隆抗 IgG、IgA、IgM、C3、C1q、κ 及 λ 抗體，室溫孵育2h，PBS洗，加FITC標(biāo)記的豬抗兔IgG室溫孵育30 min，水洗，吹干，甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

結(jié)果分析 采用免疫熒光半定量分析，按熒光強(qiáng)度0分:無熒光;0.5分:熒光很弱;1分:可見熒光;2分:較強(qiáng)熒光;3分:強(qiáng)熒光。

結(jié) 果

冰凍組織切片腎小球平均5個(gè)(3～8個(gè))，石蠟組織切片腎小球14個(gè)(9～26個(gè))。冰凍和石蠟組織切片染色的平均強(qiáng)度分析結(jié)果見表1。石蠟切片免疫熒光染色的分布、強(qiáng)度與診斷用的冰凍切片染色基本一致，診斷符合率達(dá)100%(表2，圖1)

膜性腎病患者 IgG、IgA、IgM、C3、C1q在冰凍和石蠟切片陽性染色均為顆粒狀沉積于血管袢。IgA、C3、C1q在患者中的陽性比例相同。IgG和C1q染色強(qiáng)度一致，C3石蠟切片染色強(qiáng)度略弱于冰凍切片(1.5 vs1.2)。冰凍切片IgM在1例患者為陽性，而石蠟切片是陰性。另1例患者IgA冰凍切片染色為0分，而石蠟切片染色為0.5分。

LN患者(2例Ⅳ型，2例Ⅳ +Ⅴ型)IgG、IgA、IgM、C3、C1q在冰凍和石蠟切片分別為顆粒狀沉積于系膜區(qū)(Ⅳ型)和系膜區(qū)及血管袢(Ⅳ+Ⅴ型)。1例冰凍切片C3染色為2分，而石蠟切片染色為1分，其余染色強(qiáng)度在兩種切片無差別。

IgA腎病中所有患者冰凍和石蠟切片IgA染色分布和強(qiáng)度均一致。C3在兩種切片的染色分布一致，但石蠟切片染色強(qiáng)度弱于冰凍切片(1.5 vs1.0)。

膜增生性腎小球腎炎和抗GBM腎炎中IgG染色分布和強(qiáng)度均一致。冰凍切片C3染色在兩種疾病中陽性比率均為66.7%(4/6)，石蠟亦為66.7%(4/6)，但平均染色強(qiáng)度也低于冰凍切片。上述幾組病例中出現(xiàn)C3染色的不一致性，均為石蠟切片染色弱于冰凍切片，但對診斷結(jié)果無影響。

鏈球菌感染后腎小球腎炎和致密物沉積病患者中，C3染色在兩種切片均為陽性，分布也一致，染色強(qiáng)度石蠟切片略弱于冰凍切片，但對診斷無影響。

所有患者κ、λ染色分布和強(qiáng)度均一致，且輕鏈沉積病和淀粉樣變性患者石蠟切片染色部位更清晰。

表1 不同腎小球疾病腎活檢組織冰凍切片和石蠟切片免疫熒光染色比較

討 論

表2 石蠟切片診斷腎小球疾病的比例

甲醛是最常用的固定劑，固定過程中Ca2+和其他二價(jià)離子與蛋白質(zhì)形成緊密復(fù)合物封閉抗原，使這些離子螯合成沉淀是抗原熱修復(fù)的關(guān)鍵［1-3］，因而抗原修復(fù)的選擇就顯得很重要。常用微波爐和高壓鍋加熱變性。微波作用于醛乙氨基的交聯(lián)，使之?dāng)嗔讯┞犊乖瓫Q定簇［4］。高壓鍋加熱是抗原修復(fù)的一種簡單有效的方法。同時(shí)利用EDTA與Ca2+形成螯合雙價(jià)金屬離子鹽，消除甲醛固定產(chǎn)生的不利因素。高溫高壓比微波處理的切片染色效果好，原因是高壓鍋加壓后可使溫度達(dá)到120℃，而微波的溫度100℃。組織在120℃的高溫下，維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的次級鏈斷裂，為抗體的結(jié)合提供了更多的機(jī)會［5］，還能提高一抗稀釋度［6］。酶消化石蠟組織的優(yōu)點(diǎn)是使細(xì)胞膜變性和打開抗原決定簇，人們嘗試應(yīng)用不同種類的蛋白酶進(jìn)行消化。文獻(xiàn)報(bào)道鏈菌蛋白酶、胰蛋白酶對腎臟病免疫復(fù)合物沉積熒光染色具有較好的效果。

目前國內(nèi)外腎組織石蠟切片抗原修復(fù)方法 李兵等［7］隨機(jī)選取20例腎活檢組織，對高溫高壓修復(fù)、胰酶抗原修復(fù)和無抗原修復(fù)進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)石蠟切片胰酶抗原修復(fù)組與冰凍切片免疫熒光染色結(jié)果基本符合;高溫高壓修復(fù)組出現(xiàn)較多的假陰性結(jié)果;無抗原修復(fù)組染色效果較差。董鴻瑞等［8］選擇乙肝相關(guān)的膜性腎病、LN、IgA腎病，比較微波加熱、胰蛋白酶和胃蛋白酶抗原修復(fù)法的異同。結(jié)果無抗原修復(fù)基本無熒光著色，微波加熱和胰酶抗原修復(fù)石蠟切片免疫熒光染色效果差，而胃蛋白酶修復(fù)效果好。兩家單位得出的結(jié)論不一致，我們分別重復(fù)了兩個(gè)單位的實(shí)驗(yàn)方法，不論用哪種方法陽性率都很低。

Fogazzi等［9］選擇了10例IgA腎病、8例膜增生性腎小球腎炎和10例LN，利用鏈霉蛋白酶消化石蠟組織，對照了冰凍切片和石蠟切片免疫熒光染色強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)在不同疾病的主要免疫復(fù)合物(如IgG在膜增生性腎小球腎炎，IgA在IgA腎病，IgG和C1q在LN)免疫熒光強(qiáng)度出現(xiàn)較高的一致性。Qualman和Keren［10］報(bào)道了52例腎活檢病例，利用胰酶消化石蠟切片，發(fā)現(xiàn)石蠟切片與冰凍切片在IgG、IgM、IgA和fibrinogen沉積等陽性一致率達(dá)80%～90%。但高達(dá)21例石蠟切片IgG、IgM和IgA在膜增生性腎小球腎炎，IgA腎病，LN腎小球的沉積部位不同。Nasr等［11］利用鏈霉蛋白酶消化石蠟組織，發(fā)現(xiàn)石蠟切片與冰凍切片IgA在IgA腎病沉積一致率達(dá)88%，κ和λ熒光染色與冰凍切片一致率為96%。而且κ，λ在GBM陽性表達(dá)較冰凍組織切片陽性率高而且染色強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)室采用的方法 我們在實(shí)際工作中嘗試了目前國內(nèi)外的方法，結(jié)果均不滿意。單獨(dú)用高溫修復(fù)腎組織石蠟切片，腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)和腎小管上皮細(xì)胞常常出現(xiàn)非特異性著色;而單獨(dú)用酶消化，陽性率很低。與已有的抗原修復(fù)方法相比，高溫修復(fù)聯(lián)合胃蛋白酶抗原修復(fù)法不僅能夠減少腎組織非特異性背景，還能提高陽性率。對腎組織進(jìn)行IgG、IgA、IgM、C3、C1q、κ 和 λ 輕鏈免疫熒光染色基本達(dá)到了冰凍切片的染色效果，并且在輕鏈沉積病和淀粉樣變性患者石蠟切片染色部位顯示得更加清晰。LN、IgA腎病、膜性腎病中IgA在石蠟切片有幾例強(qiáng)于冰凍切片，可能與免疫復(fù)合物沉積不一致有關(guān)。IgM和C3染色石蠟切片染色強(qiáng)度和陽性率低于冰凍切片，但不影響診斷。石蠟切片應(yīng)用此方法進(jìn)行免疫熒光染色取得了與診斷用冰凍組織相同的結(jié)果，因此，我們認(rèn)為此方法可以作為冰凍切片無腎小球的替代方法。

有報(bào)道利用高壓鍋熱修復(fù)會導(dǎo)致組織破碎，尤其是小組織［12，13］。長時(shí)間酶消化會使組織結(jié)構(gòu)破壞［8，12］，我們用防脫片劑(多聚賴氨酸)處理過的載玻片進(jìn)行撈片，并且摸索抗原修復(fù)合理的溫度和時(shí)間［5，14，15］，高壓鍋煮的時(shí)間不能太長，噴氣后 2 min關(guān)閉，酶消化的時(shí)間為5～8 min，太短消化不足，太長容易把組織消化掉。以切片未脫落、抗原定位準(zhǔn)確、染色清晰度和背景來判定最佳的修復(fù)方法［16，17］。

目前國內(nèi)外石蠟切片修復(fù)后仍采用直接免疫熒光法進(jìn)行染色，其特異性高，節(jié)省時(shí)間，操作簡單，但敏感性差。雖然利用抗原修復(fù)方法可以暴露甲醛固定的石蠟切片中的抗原，但抗原敏感性仍較低，因此所用的熒光素標(biāo)記抗體稀釋倍數(shù)很低，比冰凍切片的稀釋倍數(shù)要低10倍左右。而我們嘗試用間接免疫熒光法進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)很好地克服了直接法的不足。不論免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)、補(bǔ)體(C3、C1q)還是κ，λ染色，高溫修復(fù)聯(lián)合胃蛋白酶修復(fù)抗原法不但使一抗的稀釋度較單獨(dú)用胰酶/胃酶/鏈霉蛋白酶提高2～20倍，且對比發(fā)現(xiàn)，石蠟切片間接免疫熒光法的熒光淬滅時(shí)間長于冰凍切片直接免疫熒光法［8］。此外，用厚1.5μm的石蠟切片，節(jié)省了珍貴的組織標(biāo)本。

1 Morgan JM，Navabi H，Schmid KW，et al.Possible role of tissue bound calciuminos in citrate mediated High temperatuye antigen retrieval.J Pathol，1994，174(4):301-307.

2 Shi SR，Cote RJ，Taylor CR.Antigen retrieval immunohistochemistry:past，present，and future.J Histochem Cytochem，1997，45(3):327-343.

3 Shi SR，Gu J，Turrens F，et al.Development of the antigen retrieval technique:philosophy and theoretical base.//In Shi SR，Gu J，Taylor CR，eds.Antigen Retrieval Techniques:Immunohistochemistry and Molecular Morphology.Natick，MA:Eaton Publishing，2000:P17-39.

4 熊正文，王伯沄.微波修復(fù)抗原技術(shù)在免疫組織化學(xué)染色中的應(yīng)用現(xiàn)狀.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，1998，14(2):177-179.

5 廖德貴，黃世章.不同的抗原修復(fù)方法對免疫組化染色結(jié)果的影響.臨床醫(yī)學(xué)工程，2009，16(3):62-63，65.

6 周航波，馬恒輝，周曉軍.應(yīng)用高溫高壓抗原修復(fù)提高第一抗體稀釋度.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2009，6:670-671.

7 李 兵，苗里寧，劉樹軍，等.腎活檢標(biāo)本石蠟切片免疫熒光染色方法的探討.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13(12):1728-1730.

8 董鴻瑞，程 虹，等.甲醛固定石蠟包埋腎組織做免疫熒光染色在病理診斷中的應(yīng)用.中華腎臟病雜志，2005，21(6):315-319.

9 Fogazzi GB，Bajetta M，Banfi G，et al.Comparison ofimmunofluorescent findings in kidney after snap-freezing and formalinfixation.Pathol Res Pract，1989，185(2):225-230.

10 Qualman SJ，Keren DF.Immunofluorescence of deparaffinized，trypsintreated renal tissues.Preservation of antigens as an adjunct todiagnosis of disease.Lab Invest，1979，41(6):483-489.

11 Nasr SH，Galgano SJ，Markowitz GS，et al.Immunofluorescence on pronase-digested paraffin sections:a valuable salvage technique for renal biopsies.Kidney Int，2006，70(12):2148-2151.

12 M?lne J，Breimer ME，Svalander CT.Immunoperoxidase versus imunofluorescence in the assessment of human renal biopsies.Am JKidney Dis，2005，45(4):674-683.

13 Marshall-Taylor CE， Cartun RW， Mandich D， et al.Immunohistochemical Detection of Immunoglobulin Light Chain Expression in B-Cell Non-Hodgkin Lymphomas Using Formalin-Fixed，Paraffin-Embedded Tissues and a Heat-Induced Epitope Retrieval Technique.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2002，10(3):258-262.

14 Shi SR，Cote RJ，Shi Y，et al.Antigen retrieval technique(Appendix).//In Shi SR，Gu J，Taylor CR，eds.Antigen Retrieval Techniques:Immunohistochemistry and Molecular Morphology.Natick，MA:Eaton Publishing，2000，P311-333.

15 Shi SR，Cote RJ，Taylor CR.Major factors influencing the effectiveness of antigen retrieval immunohistochemistry.//In Shi SR，Gu J，Taylor CR，eds.Antigen Retrieval Techniques:Immunohistochemistry and Molecular Morphology.Natick，MA:Eaton Publishing，2000，P41-53.

16 Keogh KA，Limper AH.Characterization of lymphocyte populations in nonspecific interstitial pneumonia.Respir Res，2005，15(6):137.

17 鄭 暉，羅洪英，顏亞暉.免疫組織化學(xué)技術(shù)常見問題分析及對策.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2007，16(1):126-128.