山雞椒植物源抑菌成分的篩選研究

殷帥文，朱 峰，劉麗萍，陳春霞，高小燕，黨兵濤，何旭梅

井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉安343009

山雞椒植物源抑菌成分的篩選研究

殷帥文*，朱 峰，劉麗萍，陳春霞，高小燕，黨兵濤，何旭梅

井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉安343009

以山雞椒為植物材料，以活性追蹤的方法測(cè)定了不同組分對(duì)幾種植物病原菌的抑制活性，并從中分離純化出一種有效抗菌物質(zhì)L1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:粗提物不同萃取相中，乙酸乙酯相的抑制作用最好，其對(duì)楊樹潰瘍病菌和蘋果霉心病菌抑制率達(dá)到75%以上;乙酸乙酯相各個(gè)組分對(duì)幾種植物病原真菌均有一定的抑制活性，其中組分6和組分7抑菌效果強(qiáng)，組分6對(duì)蘋果霉心病菌抑制率達(dá)到100%，組分7對(duì)番茄灰霉病菌抑制率達(dá)到100%;而對(duì)抑菌活性物質(zhì)L1的抑菌活性研究中，隨著L1濃度逐漸升高，對(duì)幾種病原菌的抑制作用也依次增強(qiáng)，尤其是對(duì)蘋果霉心病菌的抑制效果更加明顯，在供試濃度為0.1 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到100%;活性成分L1最終通過波譜學(xué)方法和文獻(xiàn)對(duì)比確定為5，8-二羥基-6，7-二甲氧基黃酮。

山雞椒;抑菌活性;篩選

隨著人們環(huán)保意識(shí)的逐漸增強(qiáng)以及對(duì)生活質(zhì)量的要求愈來愈高，化學(xué)農(nóng)藥的使用所導(dǎo)致的社會(huì)和生態(tài)問題受到人們的日益關(guān)注。20世紀(jì)80～90年代，國(guó)內(nèi)外許多專家認(rèn)為，化學(xué)農(nóng)藥的使用將走到盡頭，逐步取而代之的將是生物防治、物理防治和綜合防治等［1，2］。所謂植物源農(nóng)藥，就是利用植物的某些部位或提取其有效成分制成具有殺蟲或殺菌作用的農(nóng)藥。植物源農(nóng)藥在我國(guó)常被稱為土農(nóng)藥，具有高效、無公害、能與環(huán)境相容、作用機(jī)理獨(dú)特及開發(fā)費(fèi)用低廉等特點(diǎn)，具有明顯的生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，利用植物資源對(duì)有害生物進(jìn)行防治，開發(fā)研究新農(nóng)藥已成為當(dāng)前農(nóng)藥化學(xué)和農(nóng)藥毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)。當(dāng)前，有關(guān)植物源農(nóng)藥的研究，主要集中在植物源殺蟲劑方面，而植物源殺菌劑的研究相對(duì)要薄弱得多，但由于近幾年農(nóng)作物菌害加重，據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，每年因植物病害造成的農(nóng)作物損失占總產(chǎn)量的10%～15%，約為700億美元，因此有關(guān)植物源殺菌劑的研究也發(fā)展十分迅速［3-5］。前人于2005年對(duì)井岡山47種植物的丙酮提取物進(jìn)行了5種病原菌抗菌活性研究，結(jié)果表明:在供試濃度為0.05 g/ mL時(shí)，山雞椒提取物抑菌效果最好，對(duì)所有供試菌抑制率均在90%以上，其中對(duì)小麥紋枯病菌表現(xiàn)強(qiáng)烈抑制作用，抑制率為100%［6］。本研究選擇這種初試具有明顯抗菌活性的植物以活性追蹤的方法進(jìn)行進(jìn)一步系統(tǒng)的抑菌活性研究，并從中找到具有明顯抑菌活性的單體化合物L(fēng)1。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、楊樹潰瘍病菌(Dothiorella gregaria)、稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、蘋果霉心病菌(Trichoticum roseum)均由井岡山大學(xué)植物病理研究室提供。

1.1.2 樣品及處理

山雞椒(Litsea cubeba)枝條采自井岡山自然保護(hù)區(qū)。常溫下陰干，粉碎備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物提取物的制備

將粉碎的山雞椒用95%的乙醇分別提取3次，每次72 h后過濾，合并3次濾液，減壓濃縮得粗提取物浸膏。

1.2.2 不同萃取相的制備

將上述提取物浸膏用水分散，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，重復(fù)三次，減壓濃縮，分別得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物，分別對(duì)不同相萃取物和粗提取物進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

1.2.3 不同極性組分的制備

將抑菌效果好的乙酸乙酯相采用硅膠層析柱進(jìn)行分離。固定相采用100～200目的硅膠填充。流動(dòng)相采用石油醚乙酸乙酯混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到9個(gè)組分，分別對(duì)9個(gè)組分進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。將抑菌效果較好的第6組分和第7組分采用硅膠層析柱進(jìn)行分離。固定相采用200～300目的硅膠填充。用氯仿∶乙酸乙酯=12∶1的洗脫液進(jìn)行洗脫。分別得到A、B、C、D、E和F、G、H、I、J、K共11個(gè)組分。用小麥赤霉病菌分別對(duì)這11個(gè)組分進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

1.2.4 晶體的制備

將上述抑菌效果好的組分C和G、H合并后采用硅膠層析柱進(jìn)行分離。固定相采用200～300目的硅膠填充。用氯仿:乙酸乙酯=12∶1的洗脫液進(jìn)行洗脫。最后分離得到結(jié)晶性物質(zhì)(L1)。對(duì)結(jié)晶物質(zhì)L1設(shè)定5個(gè)濃度，分別為0.01、0.025、0.05、0.1、0.2 mg/mL，分別進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

1.2.5 山雞椒提取物不同組分抑菌活性測(cè)定

山雞椒提取物不同組分對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的作用采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定［7］。在無菌的條件下，取1.2制備的樣品溶液0.5 mL于滅菌的10 mL試管中，加入9.5 mL 50℃左右的PDA培養(yǎng)基，搖勻，倒入滅菌培養(yǎng)皿中制成平板，平板凝固后放入生長(zhǎng)一致的菌餅(直徑6 mm)，每處理重復(fù)3次，27℃下培養(yǎng)4 d觀察結(jié)果。同時(shí)采用溶解樣品的相應(yīng)溶劑作為對(duì)照。用十字交叉法測(cè)量供試真菌菌落的生長(zhǎng)直徑，用下述公式計(jì)算抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑)×100%

表1 山雞椒粗提取物和不同相萃取物對(duì)6種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 1 Inhibition rate of crude extract and different soluble fractions isolated from ethanol extracts of Litsea cubeba on hypha of 6 kinds of pathogen

2 結(jié)果與分析

2.1 粗提物和不同萃取相對(duì)6種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

粗提物和不同萃取相對(duì)6種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用結(jié)果如表1。結(jié)果表明:在供試濃度為1 mg/mL時(shí)，不同萃取相和提取物對(duì)幾種植物病原真菌均有一定的抑制活性，但是乙酸乙酯相的抑制效果最好，對(duì)楊樹潰瘍病菌和蘋果霉心病菌抑制率達(dá)到75%以上。

2.2 乙酸乙酯相不同極性組分對(duì)6種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

不同極性組分對(duì)6種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用結(jié)果如表2。結(jié)果表明:在供試濃度為0.5 mg/ mL時(shí)，組分6和組分7抑菌效果較明顯，其中組分6對(duì)蘋果霉心病菌抑制率達(dá)到100%，對(duì)小麥赤霉病菌和楊樹潰瘍病菌抑制率分別為 73.72%和85.18%，組分 7對(duì)番茄灰霉病菌抑制率達(dá)到100%，對(duì)小麥赤霉病菌和楊樹潰瘍病菌抑制率分別為68.06%和71.29%。

2.3 組分6和組分7中不同組分對(duì)小麥赤霉病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

組分6和組分7中不同組分對(duì)小麥赤霉病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用結(jié)果如表3、表4。結(jié)果表明:在供試濃度為0.2 mg/mL時(shí)，組分C，組分G和組分H抑菌效果較好，對(duì)小麥赤霉病菌抑制率為分別為68.10%，70.93%和68.10%。

表2 乙酸乙酯相不同極性組分對(duì)6種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 2 Inhibition of different fractions of ethyl acetate soluble fractions isolated from ethanol extracts on hypha of 6 kinds of pathogen fungi

表3 組分6中不同組分對(duì)小麥赤霉病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 3 Inhibition of different fractions from the sixth on hypha of F.graminearum

2.4 不同濃度下L1對(duì)幾種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

不同濃度下L1對(duì)幾種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用結(jié)果如表5、表6。結(jié)果表明:隨著L1濃度逐漸升高，對(duì)小麥赤霉病菌、楊樹潰瘍病菌、蘋果霉心病菌、油菜菌核病菌這4種病原菌的抑制作用也依次增強(qiáng)，尤其是對(duì)蘋果霉心病菌的抑制效果更加明顯，在供試濃度達(dá)到0.1 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到100%。在供試濃度達(dá)到0.2 mg/mL時(shí)，除稻瘟病菌外其余5種病原菌抑制率均在50%以上。

表4 組分7中不同組分對(duì)小麥赤霉病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 4 Inhibition of different fractions from the seventh on hypha of Fusarium graminearum

表5 在0.2 mg/mL濃度下L1對(duì)6種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 5 Inhibition of the L1 on hypha of 6 kinds of pathogen fungi under the concentration of 0.2 mg/mL

表6 4種不同濃度下L1對(duì)4種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 6 Inhibition of the L1 on hypha of 4 kinds of pathogen fungi under the four different concentrations

2.5 L1的鑒定

對(duì)獲得的結(jié)晶L1進(jìn)行了核磁共振及質(zhì)譜等分析，同時(shí)與文獻(xiàn)對(duì)照［2，8］，確定其結(jié)構(gòu)為5，8-二羥基-6，7-二甲氧基黃酮(5，8-dihydroxy-6，7-dimethoxyflavone)。其結(jié)構(gòu)式如圖1，波譜數(shù)據(jù)如下:ESIMS m/z (rel.int.):315［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3):6.69(1H，s，H-3)，7.94(2H，m，H-2'，6')，7.56(3H，m，H-3'，4'，5')，4.05(3H，s，OCH3)，4.03 (3H，s，OCH3)，12.71(2H，s，OH);13C NMR(100 MHz，CDCl3):163.5(C-2)，104.6(C-3)，183.0(C-4)，144.6(C-5)，128.4(C-6)，141.4(C-7)，136.2 (C-8)，148.2(C-9)，106.5(C-10)，130.7(C-1')，126.6(C-2'，6')，129.0(C-3'，5')，132.1(C-4')，60.4(OMe)，61.1(OMe).

圖1 L1的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of compound L1

3 討論

當(dāng)前有關(guān)植物源殺菌劑的研究，主要可以分為兩方面:一方面是直接研究植物中的粗提取物，此類研究過程簡(jiǎn)單，投資少，而且能夠發(fā)揮粗提取物中各種成分的協(xié)同作用，但研究的深度不夠。目前，我國(guó)學(xué)者在這方面做的工作較多［9，10］。另一方面是間接研究，即研究粗提取物中活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、結(jié)構(gòu)與活性間的關(guān)系，進(jìn)而人工模擬合成篩選，從中開發(fā)新型植物源農(nóng)藥制劑。間接研究是當(dāng)前國(guó)外植物源殺菌劑研究開發(fā)的重點(diǎn)，也是我國(guó)植物源殺菌劑研究發(fā)展的方向。隨著我國(guó)各級(jí)政府和企業(yè)對(duì)新農(nóng)藥研制的投入加大以及研究隊(duì)伍的擴(kuò)大，我國(guó)的研究重點(diǎn)正從植物的粗提取物研究轉(zhuǎn)向更深層次的活性先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化、活性成分的構(gòu)效關(guān)系、作用機(jī)制、分子毒理學(xué)、制劑加工和工藝水平上。本研究通過抗菌活性追蹤，從山雞椒中分離純化出1種有效抗菌成分L1，在供試濃度達(dá)到0.2 mg/mL時(shí)，L1對(duì)小麥赤霉病菌，番茄灰霉病菌，楊樹潰瘍病菌，油菜菌核病菌，蘋果霉心病菌5種植物病源真菌具有超過50%的抑制率，特別是對(duì)蘋果霉心病菌的抑制在供試濃度為0.1 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到100%，L1可進(jìn)一步開發(fā)為蘋果霉心病菌的專一性植物源殺菌劑。

江西省地處亞熱帶，是近代植物區(qū)系的起源中心之一，植物系統(tǒng)演化中各個(gè)階段的代表植物江西均有分布，同時(shí)，獨(dú)特的環(huán)境條件能使生物產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)復(fù)雜、新穎、生理活性特異的代謝產(chǎn)物。江西省植物資源豐富，因此，從江西省植物資源中尋找植物源殺菌劑的先導(dǎo)化合物頗具潛力。然而，根據(jù)我們的文獻(xiàn)資料，除我們研究小組于2005年對(duì)井岡山47種植物的丙酮提取物進(jìn)行了5種病原菌抗菌活性研究外［6］，尚未見其他有關(guān)江西省植物殺菌劑活性成分的研究報(bào)道。因此，我們的對(duì)山雞椒抑菌活性的成分研究具有重要的理論意義。在此先導(dǎo)化合物基礎(chǔ)上，配合適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)修飾、優(yōu)化改造以及系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究，可以進(jìn)一步研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、高效、低毒的植物源殺菌劑新藥。而且山雞椒在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，其中江西分布廣泛，其中井岡山和廬山分布較多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步為江西省豐富的植物資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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Screening Antifungal Component from Litsea cubeba

YIN Shuai-wen*，ZHU Feng，LIU Li-ping，CHEN Chun-xia，GAO Xiao-yan，DANG Bing-tao，HE Xu-mei
School of life sciences，Jinggangshan University，Ji'an 343009，China

The bioactivity-guided screening of different fractions of Litsea cubeba extract was tested with several kings of fungi which result in an antifungal compound L1.The results showed all fractions exhibited inhibitory action on tested different fungi，and the ethyl acetate soluble fractions showed more significant inhibition than other soluble fractions isolated from ethanol extracts to Dothiorella gregaria and Trichoticum roseum.Fractions 6 and 7 of ethyl acetate soluble fractions isolated from ethanol extracts showed stronger antifungal bioactivity than others.The inhibiting effect on tested fungi was enhancing as the concentration of compound L1 rising.And L1 showed 100%inhibition ratio to Trichoticum roseum at the concentration of 0.1 mg/mL.The structures of L1 was identified as 5，8-dihydroxy-6，7-dimethoxyflavone on the basis of extensive spectral analysis and comparison with the literature.

Litsea cubeba;antifungal activity;screening

1001-6880(2011)04-0734-05

2010-02-24 接受日期:2010-06-12

江西省自然科學(xué)基金(2007GQN1687)，江西省教育廳項(xiàng)目(贛教技字［2007］327號(hào))

*通訊作者 E-mail:shwyin@jgsu.edu.cn

Q946.33

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