HPLC測(cè)定葛花中6″-O-木糖鳶尾苷的含量

姚美村，廖祎婷，袁月梅，高 越，湯 毅

中山大學(xué)藥學(xué)院藥，廣州510006

HPLC測(cè)定葛花中6″-O-木糖鳶尾苷的含量

姚美村，廖祎婷，袁月梅，高 越，湯 毅*

中山大學(xué)藥學(xué)院藥，廣州510006

本文建立了葛花中6″-O-木糖鳶尾苷含量測(cè)定的HPLC方法。采用GRACE C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，柱溫為室溫。6″-O-木糖鳶尾苷的峰面積(Y)與濃度(X)在10.33～185.99 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，Y=30731X–216635，r= 0.9992(n=7);平均回收率為100.2%，RSD＜2%(n=9);測(cè)得8批葛花藥材中6″-O-木糖鳶尾苷含量為11.08～48.23 mg/g。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明該法準(zhǔn)確、可靠，可用于葛花中主要成分6″-O-木糖鳶尾苷的含量測(cè)定。

葛花;6″-O-木糖鳶尾苷;高效液相色譜法;解酒;不同產(chǎn)地

葛花又名葛條花，是豆科(Leguminasae)植物野葛(Pueraria Lobata(Willd.)Ohwi)或干葛藤(P.thomsonii Benth.)的干燥花，中醫(yī)主要用于解酒醒脾，是很具代表性的解酒藥物［1］，著名解酒方劑“葛花解醒湯”已流傳使用數(shù)百年?，F(xiàn)代研究已證實(shí)葛花確有解酒和護(hù)肝作用［2］，近年來(lái)的相關(guān)研究多集中于異黃酮成分方面，認(rèn)為該類成分是解酒的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［3，4］。目前，葛花質(zhì)量控制常采用葛根素為對(duì)照品，以紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量［5］;也有報(bào)道以葛花苷等為對(duì)照品，采用高效液相色譜法測(cè)定了其中的部分黃酮類成分［6］。本研究在對(duì)不同來(lái)源葛花藥材分析中發(fā)現(xiàn)葛花苷和葛根素的含量非常低，而另外兩種異黃酮成分——鳶尾苷和6″-O-木糖鳶尾苷的含量則相對(duì)較高。本文建立了葛花中6″-O-木糖鳶尾苷含量測(cè)定的HPLC方法，并對(duì)8批不同產(chǎn)地葛花中的該成分進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Waters高效液相色譜系統(tǒng)(含Waters 1525泵，Waters 2487雙通道紫外檢測(cè)器，Waters 717plus自動(dòng)進(jìn)樣器，Breeze色譜工作站，美國(guó)Waters公司);電子恒溫水浴鍋(廣東省汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠);DZF-6051型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司); SB25-12D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

甲醇(分析純，江蘇漢邦科技有限公司)，乙腈(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)，超純水;6″-O-木糖鳶尾苷(自制，經(jīng)HPLC歸一化法測(cè)定純度為99.1%);8批葛花藥材(廣州市藥材公司)，經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)王軍副教授鑒定為野葛(Pueraria Lobata(Willd.)Ohwi)的干燥花，標(biāo)本存于中山大學(xué)藥學(xué)院(No.20071019)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

GRACE C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美國(guó)格雷斯公司)色譜柱，流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B)，線性梯度洗脫，(A∶B∶0 min 15∶85;35 min 50∶50;36 min 15∶85;40 min 15∶85;v/v);流速:0.8 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):265 nm;室溫。

1.2.2 供試品溶液的制備

取葛花藥材約50 g，精密稱定，以70%乙醇500 mL浸泡1 h后，在水浴中回流提取1 h。藥渣用70%乙醇400 mL，在同樣條件下提取兩次，每次1 h，合并提取液。將提取液減壓回收乙醇后，殘余物置真空干燥箱中干燥，稱重。精密稱取干燥提取物約20 mg，用80%甲醇少量超聲溶解后，以80%甲醇定容于50 mL量瓶中，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取6″-O-木糖鳶尾苷對(duì)照品9.3 mg，以少量80%甲醇超聲溶解，置于50 mL量瓶中，以80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含量為185.99 μg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取按“1.2.2”和“1.2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液和對(duì)照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取上述185.99 mg/mL的對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL和10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為10.33、30.99、61.99、92.99、124.00、155.00 μg/mL和185.99 μg/mL的對(duì)照品溶液;分別精密吸取上述7個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)6″-O-木糖鳶尾苷的濃度(X)進(jìn)行線性回歸。

1.2.6 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液10 μL，在同一條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定6″-O-木糖鳶尾苷的吸收峰面積。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的葛花樣品，平行稱定6份，分別按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，每份精密吸取10 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算6″-O-木糖鳶尾苷的含量，RSD為0.88%，表明本法重復(fù)性較好。

1.2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已測(cè)定6″-O-木糖鳶尾苷含量的葛花樣品適量，精密稱定9份，每3份加入相同量的6″-O-木糖鳶尾苷對(duì)照品，分別按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 樣品測(cè)定

取8批不同來(lái)源的葛花樣品，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，測(cè)定6″-O-木糖鳶尾苷的峰面積，并計(jì)算各樣品中6″-O-木糖鳶尾苷的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 6″-O-木糖鳶尾苷理論塔板數(shù)為11732，6″-O-木糖鳶尾苷峰與各相臨峰的分離度均大于1.5，對(duì)應(yīng)圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 6″-O-木糖鳶尾苷對(duì)照品(A)及葛花藥材(B)的HPLC色譜圖Fig.1 The representative HPLC chromatograms of(A)6″-O-xylosyl-tectoridin standard and(B)a 70%ethanol extract of Flos Pueraria from Jiangsu province a.6″-O-木糖鳶尾苷;a.6″-O-xylosyl-tectoridin

2.2 6″-O-木糖鳶尾苷回歸方程為Y=30731X–216635，r=0.9992(n=7)，表明其濃度在10.33～185.99 μg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD為0.78%，表明精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果RSD為0.88%，表明本法重復(fù)性較好。加樣回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，平均回收率為100.2%，RSD為2.4%。

2.3 樣品測(cè)定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地葛花藥材中均檢測(cè)到6″-O-木糖鳶尾苷，其含量隨產(chǎn)地不同而有變化。8批葛花樣品中6″-O-木糖鳶尾苷的含量見(jiàn)表2

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Table 1 Recoveries of 6″-O-xylosyl-tectoridin in Flos Pueraria samples(n=9)

表2 不同產(chǎn)地樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 2 The contents of 6″-O-xylosyl-tectoridin in Flos Pueraria samples from 8 origins of production in China(n=3)

2.4 討論

2.4.1 在對(duì)不同來(lái)源葛花樣品進(jìn)行HPLC分析的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)鳶尾苷和6″-O-木糖鳶尾苷的含量非常高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了葛花苷的含量，為了更好的測(cè)定葛花中異黃酮成分的含量，本研究建立了葛花藥材中主要異黃酮類成分6″-O-木糖鳶尾苷的HPLC測(cè)定方法，并對(duì)不同產(chǎn)地的葛花中的6″-O-木糖鳶尾苷進(jìn)行了含量測(cè)定。結(jié)果表明，該方法中6″-O-木糖鳶尾苷的色譜峰面積與其濃度具有良好的線性關(guān)系，精密度和重復(fù)性都較好，平均加樣回收率為100.2%;8批不同來(lái)源的葛花藥材中均明顯檢測(cè)到有較高含量的6″-O-木糖鳶尾苷存在，其含量在11.08～48.23 mg/g范圍內(nèi)。

2.4.2 現(xiàn)代藥理學(xué)研究已證實(shí)，葛花發(fā)揮解酒作用的主要有效成分是異黃酮化合物［1］，其中的主要成分為葛花苷。然而本研究在對(duì)不同來(lái)源葛花樣品的HPLC分析中，即使采用文獻(xiàn)［6］報(bào)道的分析方法，也沒(méi)有檢測(cè)到有明顯的葛花苷存在。Kim CS等［7］的研究結(jié)果表明，在儲(chǔ)放5年以內(nèi)的葛花中幾乎檢測(cè)不到葛花苷，而主要為鳶尾苷和6″-O-木糖鳶尾苷等成分［7］，本研究結(jié)果也表明，放置時(shí)間較短的葛花藥材中的鳶尾苷和6″-O-木糖鳶尾苷確實(shí)含量比較高，而葛花苷和葛根素幾乎檢測(cè)不到。因此，本研究在建立了鳶尾苷含量測(cè)定方法之外，又建立了葛花中另外一種主要成分6″-O-木糖鳶尾苷的含量測(cè)定方法，為更全面評(píng)價(jià)葛花的質(zhì)量提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

2.4.3 本研究建立了葛花中6″-O-木糖鳶尾苷的含量測(cè)定方法，可用于葛花藥材中此類成分的定量分析。然而，與已有文獻(xiàn)中認(rèn)為葛花苷為葛花特異性成分相比，6″-O-木糖鳶尾苷是否可以單獨(dú)作為葛花的定量分析指標(biāo)，或者是否可以與另外一種主要成分鳶尾苷共同作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，仍有待通過(guò)對(duì)更多不同產(chǎn)地的葛花樣品，結(jié)合相應(yīng)的藥理藥效實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面綜合考察和評(píng)價(jià)。

1 Yin JT(尹俊亭)，Zhong Y(仲英)，Sun JY(孫敬勇).Review of researches progress on Pueraria lobata.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2005，36:1905-1906.

2 Chinese Materia Medica Editorial Board in State Administration of Traditional Chinese Medicine(國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)).Chinese Materia Medica 4(中華本草4).Shanghai:Shanghai Science and Technology Press，1999.619.

3 Lee HW，Choo MK，Bea EA.β-Glucuronidase inhibitor tectorigenin isolated from the flower of Pueraria thunbergiana protects carbon tetrachloride induced liver injury.Liver Int，2003，23:221.

4 Han YO，Han MJ，Park SH，et al.Protective effects of kakkalide from Flos Puerariae on ethanol-induced lethality and hepatic injury are dependent on its biotransformation by human intestinal microflora.J Pharmacol Sci，2003，93:331-336.

5 Li W(李文)，He D(賀殿)，Wang X(王曉)，et al.Determination of total flavonoids in Flos Puerariae.Northwest Pharm J(西北藥學(xué)雜志)，2005，20:14-15.

6 Zhang SP(張淑萍)，He Y(賀云)，Liu BT(劉柏濤).Determination of kakkalide，kakkalidone and irisolidone in the flowers of Pueraria lobata by RP-HPLC.Chin J Anal Lab(分析試驗(yàn)室)，2006，25:74-76.

7 Kim CS，Shin SM，Ha HK，et al.Study of substance changes in flowers of Pueraria thunbergiana Benth.during storage.Arch Pharm Res，2003，26:210-213.

Determination of 6″-O-xylosyl-tectoridin in Flos Puerariae by HPLC

YAO Mei-cun，LIAO Yi-ting，YUAN Yue-mei，GAO Yue，TANG Yi*
School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China

An HPLC method for determination of 6″-O-xylosyl-tectoridin in Flos Puerariae was developed.The samples were separated on a C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)column with the mobile phase of acetonitrile-water(gradient elution).Flow rate was 0.8 mL/min.The detection wavelength was set at 265 nm.Column temperature was ambient temperature.The linear range of 6″-O-xylosyl-tectoridin was 10.33-185.99 μg/mL，and the linear function was Y=30731X–216635(r=0.9992).The average recovery was 100.2%，and RSD was less than 2%(n=9).The contents of 6″-O-xylosyl-tectoridin in Flos Puerariae was 11.08-48.23 mg/g.The method was accurate and reliable，which can be used to evaluate the qualities of Flos Puerariae.

Flos Puerariae;6″-O-xylosyl-tectoridin;HPLC;hangover alleviating;different origins of production

1001-6880(2011)05-0898-04

2009-12-14 接受日期:2010-04-08

中山大學(xué)2008年實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目″葛花異黃酮類成分的藥動(dòng)/藥效學(xué)研究″資助

*通訊作者 E-mail:Tigertang@21cn.com

R284.1

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