黃花鐵線蓮化學(xué)成分阿魏酸對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用

涂院海，楊曉軍

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科，陜西 延安 716000)

黃花鐵線蓮化學(xué)成分阿魏酸對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用

涂院海，楊曉軍

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科，陜西 延安 716000)

目的研究延安本地植物黃花鐵線蓮化學(xué)成分阿魏酸在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中的藥用價(jià)值。方法通過硅膠和凝膠柱色譜分離，利用多種波譜技術(shù)鑒定黃花鐵線蓮，獲得5種化合物，將其中的有效成分阿魏酸進(jìn)行動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)及抗炎活性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果化合物阿魏酸無急性毒性反應(yīng)，并且具有良好的抗炎活性。結(jié)論延安本地生長(zhǎng)植物黃花鐵線蓮所提取化學(xué)成分阿魏酸具有良好的抗炎活性，對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有很好的藥用價(jià)值。

黃花鐵線蓮(ChematisintricataBunge)；阿魏酸；抗炎活性；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

黃花鐵線蓮(ChematisintricataBunge)是我國(guó)北方各省普遍生長(zhǎng)的，毛莨科鐵線蓮屬野生草本植物，別名狗豆蔓、蘿蘿蔓，商品名透骨草。具有祛風(fēng)除濕、活血止痛、消腫作用[1]。民間常有用鮮草搗爛外敷治療關(guān)節(jié)、軟組織腫痛。為了進(jìn)一步挖掘中草藥在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中的有效途徑，提高臨床療效、減少西藥帶來的不良反應(yīng)，為最終進(jìn)入臨床應(yīng)用研究奠定理論基礎(chǔ)。作者收集位于延安山區(qū)的野生植物黃花鐵線蓮全草，通過硅膠和凝膠柱色譜分離，利用多種波譜技術(shù)鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)，獲得5種化合物，選擇其中3種成分，分別進(jìn)行了動(dòng)物急毒實(shí)驗(yàn)和抗炎活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果3種成分均未發(fā)現(xiàn)急性毒性反應(yīng)，且均具有良好的抗炎消腫作用。本文僅對(duì)第三種化學(xué)成分阿魏酸(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)編號(hào)KSHT-I)進(jìn)行動(dòng)物急毒及抗炎活性實(shí)驗(yàn)做重點(diǎn)報(bào)道，探討對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

XRC-1型顯微熔點(diǎn)儀；Pekin-Elmer 983G型紅外光譜儀(KBr壓片)；Bruck-AR×500型核磁共振儀(TMS內(nèi)標(biāo))；MAT-711型質(zhì)譜儀；VarioEL有機(jī)元素分析儀；SephadexLH-20(Pharmacia產(chǎn)品)；柱層析硅膠(100～200目)青島海洋化工廠產(chǎn)品(PIHAO)：黃花鐵線蓮全草采自陜西省甘泉縣，由延安大學(xué)生命科學(xué)院劉世鵬老師鑒定。

1.2 提取和分離

新鮮全草晾干20 kg，用70%的乙醇常溫下浸泡5 d，將提取液減壓濃縮得暗黑色浸膏。將該浸膏混懸于水中，依次用石油醚(6℃～90℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑得石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。乙酸乙酯萃取物經(jīng)柱層析分離(氯仿-甲醇梯度洗脫)，共得化合物：1號(hào)(3505 mg)，2號(hào)(1872 mg)，3號(hào)(2123 mg)，4號(hào)(45 mg)，5號(hào)(59 mg)。

結(jié)構(gòu)鑒定：所得化合物3:(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)編碼KSHT-1):白色針晶(甲醇)，m.p.172℃～173℃，IR(KBr)cm-1:3431(-OH)，3020～2502(寬峰)，1690(羧C=O)，1627，1516(C=C)。ESI(+)-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z195[M+H]；元素分析得碳、氫的百分含量分別為61.80、5.17；質(zhì)譜和元素分析推出該化合物的分子式C10H10O4，相對(duì)分子質(zhì)量：194。1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:3.83(3H，s)，6.35(1 H，d，J=15.6 Hz，H-8)，6.76(d，J=8.0 Hz，H-5)，7.08(dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6)，7.28(d，J=2.0 Hz，H-2)，7.50(d，J=15.6 Hz，H-7);13CNMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:55.6(-OCH3)，112.3(C-2)，115.4(C-5)，115.7(C-6)，122.8(C-8)，125.7(C-1)，144.3(C-7)，147.8(C-4)，149.1(C-3)，167.7(C-9)。其理化數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[5]，故鑒定為阿魏酸。

2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1 急毒實(shí)驗(yàn)

2.1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?分組后，在24 h內(nèi)給藥2次，觀察小鼠接受過量所產(chǎn)生的急性中毒反應(yīng)，為多次反復(fù)給藥的毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量、分析毒性作用的靶器官、分析人體過量時(shí)可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、臨床劑量選擇和觀察指標(biāo)的設(shè)計(jì)提供參考信息等。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)條件 動(dòng)物品系：昆明種小鼠體重18～22 g，♀♂各半，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，二級(jí)動(dòng)物，合格證號(hào)NO：0034180，許可證號(hào)：SCXK-(軍)2007-007。本實(shí)驗(yàn)在二級(jí)動(dòng)物室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)回后適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組后標(biāo)記樣品名稱、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類、性別及組別。凈化室溫度保持在20℃～25℃；相對(duì)濕度保持在45%-70%。

2.1.3 受試藥物名稱 KSHT-I—阿魏酸。來源：延安大學(xué)附屬醫(yī)院。批號(hào)：20110501

配制：最大受試藥物量實(shí)驗(yàn)：取200 mg阿魏酸加色拉油至6 ml，濃度33.3 mg/ml，呈乳色泛黃液體.

實(shí)驗(yàn)方法：取小鼠40只，♀♂各半，體重18～22 g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組及給藥組，每組各20只小鼠，給藥前禁食12 h，給藥組以33.3 mg/ml濃度的KSHT-I乳懸液，按0.4 ml/10g灌胃，每天2次灌胃給藥，對(duì)照組給與同體積色拉油，連續(xù)觀察14 d，詳細(xì)記錄小鼠行為活動(dòng)、狀態(tài)、飲食、大小便及毛色、分泌物等。

2.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 給藥后，小鼠大便正常呈濕潤(rùn)顆粒狀，無死亡，活動(dòng)自如，進(jìn)食、飲水均正常，皮毛光潔，口、鼻、眼及肛門清潔無分泌物，連續(xù)觀察兩周，體重有增加，給藥前體重、第7日、第14日體重見表1，給藥組體重與對(duì)照組體重?zé)o顯著性差異。解剖所見：胸腔與腹腔未見異常液體，腸管未見脹氣，心、肝、脾、肺、腎等重要臟器未見顏色、形態(tài)異常，沒有出血點(diǎn)或其它病理改變，胃粘膜顏色紅潤(rùn)，無出血點(diǎn)或潰瘍，尸檢無異常。

2.1.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 KSHT-I給昆明種小鼠灌胃未測(cè)出LD50，24 h內(nèi)給藥2次，觀察14 d，小鼠無死亡，也無明顯中毒反應(yīng)。其最大受試藥物量為2664 mg/kg，在此劑量下未觀察到KSHT-I的急性毒性反應(yīng)。結(jié)果見表1。

表1 KSHT-I急毒小鼠體重

注：給藥組與對(duì)照組比較P>0.05

2.2 抗炎活性實(shí)驗(yàn)

KSHT-I實(shí)驗(yàn)組通過叉菜膠致大鼠足跖腫脹及二甲苯致小鼠耳腫脹，利用藥物復(fù)方七葉皂苷鈉乳膏做對(duì)比，觀察KSHT-1外涂致炎部位對(duì)腫脹的減輕程度。

2.2.1 試驗(yàn)材料

(1)受試藥物：：KSHT-I—阿魏酸。來源：延大附屬醫(yī)院。批號(hào)：20110501。

(2)陽(yáng)性藥物：復(fù)方七葉皂苷鈉凝膠，國(guó)藥準(zhǔn)字H20020168，批號(hào)：20100953，規(guī)格：20 g/支，有效期至2012年8月，山東綠葉制藥有限公司生產(chǎn)。

(3)儀器及試劑：天平，型號(hào)：1012-PT，精密度為0.1 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；足趾容積測(cè)量?jī)x，型號(hào)：YLS-7A，山東醫(yī)科大學(xué)生產(chǎn)；微量加樣器。

(4)配制：取100 mg加香油至3 ml，濃度33.3 mg/ml，呈乳色泛黃液體。

(5)動(dòng)物：ICR小鼠，SD大鼠，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：NO：0003240，許可證號(hào)：SCXK(陜)2007-001。

(6)試驗(yàn)方法及結(jié)果

劑量設(shè)置：

小鼠：大劑量每鼠耳涂100 μl，小劑量每鼠耳涂50 μl。小鼠體重按20 g計(jì)，即大劑量5 ml/kg(166.5 mg/kg)，小劑量2.5 ml/kg(83.25 mg/kg)。

大鼠：大劑量每鼠足涂0.4 ml，小劑量每鼠足涂0.2 ml。大鼠體重按100 g計(jì)，即大劑量4 ml/kg(133.2 mg/kg)，小劑量2 ml/kg(66.6 mg/kg)。

2.2.2 KSHT-I對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響

按文獻(xiàn)方法[1]取SD大鼠40只，體重80～110 g，雌雄各半。隨機(jī)分為4組，每組10只。分別為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(復(fù)方七葉皂苷鈉凝膠)、KSHT-I大、小劑量組。每鼠采用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量標(biāo)記位置以下的右后肢的容積(ml)，作為致炎前正常值，然后，分別在大鼠右后肢足跖皮下注射1%角叉菜膠混懸液0.1 ml/只致炎。即可涂藥：大劑量組每鼠右后肢足跖皮膚涂0.4 ml，小劑量組每鼠右后肢足跖皮膚涂0.2 ml，陽(yáng)性對(duì)照組每鼠右后肢足跖皮膚涂0.4 ml。致炎即給藥后1 h，采用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量標(biāo)記位置以下的右后肢的容積(ml)，以后每隔1h用以上方法測(cè)右后肢足跖容積，共測(cè)量5 h。并計(jì)算腫脹度，腫脹度=給藥后足容積(ml)-給藥前足容積(ml)，各組與模型對(duì)照組比較，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果見表2。

表2可見，與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、本品133.2 mg/kg組從致炎后1～5 h，能明顯抑制角叉菜膠致大鼠足跖腫脹。提示，KSHT-I對(duì)化學(xué)性炎癥有抑制作用。

2.2.3 KSHT-I對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

按文獻(xiàn)[2]方法，取健康ICR小鼠10只，體重18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組10只。分別為模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組(復(fù)方七葉皂苷鈉凝膠)，KSHT-I大、小劑量組。給小鼠右耳前后兩面涂二甲苯約50 μl，左耳做正常對(duì)照。即可涂藥：大劑量組每小鼠右耳前后兩面皮膚涂100 μl，小劑量組每小鼠右耳前后兩面皮膚涂50 ul，陽(yáng)性對(duì)照組每小鼠右耳前后兩面皮膚涂100 μl。致炎即給藥后1 h后，將小鼠脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用9 mm打孔器在左右耳同一位置打孔，電子天平上稱重，右耳重量減去左耳重量為腫脹度，腫脹度除以左耳重量乘以100即為小鼠耳腫的腫脹百分率，組間比較，t檢驗(yàn)。結(jié)果見表3。

從表3可以看出，KSHT-I大組劑量組能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹。提示本品對(duì)急性炎性有一定的抑制作用。

表2 KSHT-I對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響

注：與模型對(duì)照組相比較*P<0.05，**P<0.01

表3 KSHT-I對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

注：與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01

3 結(jié)果

黃花鐵線蓮中提取化合物阿魏酸通過動(dòng)物急毒實(shí)驗(yàn)，均無明顯的毒性反應(yīng)，給藥組與對(duì)照組比較P>0.05。通過小鼠和大鼠耳重實(shí)驗(yàn)和足跖腫實(shí)驗(yàn)，與復(fù)方七葉皂苷鈉乳膏模型對(duì)照組對(duì)比，有良好的抗炎消腫作用。與對(duì)照組比較分別給藥組與對(duì)照組比較P<0.05和P<0.05。

4 討論

在科學(xué)飛速發(fā)展，技術(shù)不斷進(jìn)步的時(shí)代，如何挖掘中醫(yī)藥潛力，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展中醫(yī)藥研究，保留和發(fā)展祖國(guó)醫(yī)藥傳統(tǒng)，更好地為人類健康服務(wù)。風(fēng)濕病牽扯多學(xué)科領(lǐng)域，病因復(fù)雜，病程長(zhǎng)，多器官損害，晚期致殘，常伴有骨關(guān)節(jié)腫痛[2]。臨床治療對(duì)于改善癥狀、控制病情、恢復(fù)功能和保護(hù)多臟器不受損害，是臨床醫(yī)生難于顧全的疑難問題。通過對(duì)黃花鐵線蓮提取的化學(xué)成分阿魏酸進(jìn)行了動(dòng)物急毒實(shí)驗(yàn)和抗炎活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明，未發(fā)現(xiàn)急性毒性反應(yīng)，且具有良好的抗炎活性。

阿魏酸(Ferulic acid)即4-羥-3-甲氧基肉桂酸或3-(4-羥基-3-甲氧苯基)-2-丙烯酸，分子量為194。具有抗血小板聚集，抑制血小板5-羥色胺釋放，抑制血小板血栓素a2(txa2)的生成，增強(qiáng)前列腺素活性，鎮(zhèn)痛，緩解血管痙攣等作用[3].研究表明阿魏酸是阿魏、川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊等多種中藥的有效成分[4]。從黃花鐵線蓮中提取尚未見報(bào)道。

中醫(yī)對(duì)黃花鐵線蓮(透骨草)藥用價(jià)值有所描述：能祛風(fēng)濕，舒筋活血，止痛[5]。外敷治療風(fēng)濕病及關(guān)節(jié)炎、腰腿痛、頸椎病等，但是局部皮膚易出現(xiàn)水泡不良反應(yīng)。透骨草有多種植物，黃花鐵線蓮具有抗炎和鎮(zhèn)痛活性[6]。將提純化學(xué)成分阿魏酸單體化合物進(jìn)行動(dòng)物活性實(shí)驗(yàn)或研究應(yīng)用于風(fēng)濕病臨床尚未查到報(bào)道。這次提純化學(xué)成分阿魏酸的動(dòng)物急毒、抗炎活性研究結(jié)果表明，植物黃花鐵線蓮提純的單體化合物阿魏酸在類濕病治療方面有較高的藥用價(jià)值，并消除了局部起水泡的不良反應(yīng)，為進(jìn)一步開發(fā)體內(nèi)用藥研究提供了有利依據(jù)，有可能成為有效、低毒、無內(nèi)臟損害的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的理想藥物。到底阿魏酸的抗炎活性作用原理是否與抑制(NTF-a、白介素等)那些致炎因子有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

[1]中醫(yī)研究院中藥研究所，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，等.全國(guó)中草藥匯編[M].第2版，北京:人民衛(wèi)生出版社出版，2009.

[2]蔣明，朱立平，林孝義。風(fēng)濕病學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社出版，1996.

[3]胡益勇，徐曉玉.阿魏酸的化學(xué)和藥理研究進(jìn)展[J].中成藥，2006(2):1-14.

[4]宋志宏，趙玉英，段京莉.黃花鐵線蓮化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，1995，20(10):613-614.

[5]宋志宏，張桂蘭，李艷梅，等.黃花鐵線蓮的化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物開發(fā)與研究雜志，1997(6):11-16.

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R931

A

1672-2639(2011)04-0022-03

延安市科技項(xiàng)目(2008KS)

2011-10-21；責(zé)任編輯徐文梅]