孔雀致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

崔煥忠，周佰祥，張 輝，范譯文，康 倩，張加力，黃海龍，王 開

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林 長春130118；2.吉林省磐石市動檢站，吉林 磐石132300）

孔雀作為集觀賞、食用、保健于一身的養(yǎng)殖珍禽，在很多地方都有養(yǎng)殖，但隨著養(yǎng)殖量的增加，患病率也在逐漸增高，尤其是大腸桿菌病。大腸桿菌常引起禽類敗血癥、氣囊炎、心包炎、肝周炎、肉芽腫、卵黃性腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、眼炎、臍炎等病理變化，具有較高的發(fā)病率和死亡率［1］。由于大腸桿菌血清型太多，并且極易產(chǎn)生耐藥性，為弄清本病流行情況及流行菌株的耐藥性，從而科學(xué)指導(dǎo)用藥，經(jīng)常對大腸桿菌病進行病原的分離鑒定及藥敏試驗，以期指導(dǎo)臨床診治。2009年11月中旬，長春某珍禽養(yǎng)殖場所飼養(yǎng)的80只6月齡孔雀先后有20幾只發(fā)生腹瀉、腫臉、流淚等癥狀，繼而死亡，經(jīng)臨床檢查、病理剖檢初步診斷為大腸桿菌病。從現(xiàn)場采集了病料，通過病原分離、生化培養(yǎng)、動物試驗等，最終確定病原體為致病性大腸桿菌。分離的大腸桿菌用臨床常用抗菌藥物進行了藥敏試驗，根據(jù)藥敏結(jié)果合理選擇藥物，有效地控制了該群孔雀的病情。有關(guān)本次試驗報告如下。

1 材料

1.1 病料 無菌采集病死孔雀的肝臟、脾臟、胰腺和心血。

1.2 主要試劑 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基參照文獻［2］配制；麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基及三糖鐵培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細菌微量生化鑒定管及藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；大腸桿菌O 型單價陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、超凈工作臺、高速低溫離心機、高壓消毒器、分光光度計、pH計、微波爐、冰箱、水浴鍋等常規(guī)設(shè)備。

1.4 試驗動物 健康小鼠10只，購自長春生物制品所。

2 方法

2.1 病毒分離 取肝臟、脾臟、胰腺等組織，制備1∶5組織懸液，低溫高速離心，取上清液，加入雙抗感做4h后，過0.45μm針式濾器，濾液經(jīng)尿囊腔接種9～10日齡雞胚，孵育。剔除24h內(nèi)死亡雞胚，24h后死亡雞胚置4℃冰箱保存。孵化至第4天，將未死亡雞胚全部置4℃冰箱4h后收取尿囊液，并將雞胚尿囊液盲傳3代，做血凝試驗（HA）［3－4］。

2.2 細菌分離 將無菌采集病死孔雀的肝臟及心血接種于血瓊脂平板，置于培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24～48h，挑取血瓊脂平板上生長比較一致的單個菌落，接種于普通營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18～24h。

2.3 培養(yǎng)特性及顯微鏡鏡檢觀察 將純化的細菌分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、三糖鐵瓊脂及伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～48h，觀察細菌生長情況；取純化細菌涂片、固定、革蘭染色后，在顯微鏡下觀察細菌染色情況。

2.4 生化試驗 將純化的疑似大腸桿菌接種于常用細菌微量生化鑒定管，置于37℃培養(yǎng)18h后觀察結(jié)果。

2.5 血清型鑒定 將麥康凱平板上的可疑菌落，接種于普通瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24h，用石炭酸鹽水洗下，形成濃縮菌液，115℃高壓制成菌體抗原，按使用說明書進行抗原－抗體平板凝集試驗，鑒定血清型［5］。

2.6 動物試驗 無菌條件下將細菌的純培養(yǎng)物用滅菌生理鹽水洗下，制成細菌數(shù)約為1.5×108CFU/mL懸液［6］。將10只小鼠隨機平均分成2組，每組5只，一組為試驗組，一組為對照組。試驗組小鼠每只腹腔注射菌懸液0.2mL；對照組每只腹腔注射滅菌生理鹽水0.2mL。隔離飼養(yǎng)，觀察小鼠的發(fā)病死亡情況。小鼠死亡后剖檢尸體，將病變組織接種于麥康凱培養(yǎng)基上，挑取可疑菌落進行鏡檢、生化鑒定。

2.7 藥敏試驗 按“紙片法抗菌藥物敏感試驗標(biāo)準”進行藥敏試驗［7］。用一無菌棉拭子蘸取校正為0.5麥氏單位的菌懸液，在管壁旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過多的菌液，均勻涂布于整個普通營養(yǎng)瓊脂平板表面，待平板上的菌液稍干后，將藥敏片依次均勻貼放到平板上。各紙片中心相距約24mm，紙片距平板邊緣約15mm，各紙片間距離相等。將平板倒置于培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)16～18h，觀察結(jié)果。以抑菌圈直徑大小作為判定細菌對藥物敏感性的標(biāo)準，以敏感、中敏或耐藥的形式解釋結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 病毒分離結(jié)果 接種雞胚后，孵化4d，結(jié)果均無死亡，收獲尿囊液進行血凝試驗，無血凝性。雞胚尿囊液盲傳3代，均無血凝性。排除了感染新城疫病毒及禽流感病毒。

3.2 細菌分離培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果 從肝臟及心血中均分離到單一細菌，將分離的細菌接種普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂平板及三糖鐵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后觀察發(fā)現(xiàn)：細菌在普通營養(yǎng)瓊脂平板生長良好，形成邊緣光滑、濕潤、半透明的灰白色菌落；在麥康凱瓊脂平板上長出紅色菌落；在伊紅美藍瓊脂平板呈現(xiàn)紫黑色具有金屬光澤的菌落；三糖鐵培養(yǎng)基產(chǎn)酸產(chǎn)氣。挑取單個菌落進行革蘭染色，在油鏡下觀察，菌體呈現(xiàn)淡紅色，為革蘭陰性、呈單個或成雙存在或呈短鏈排列的短桿菌。

3.3 生化試驗 將純化的疑似大腸桿菌分別接種葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇等細菌微量生化鑒定管，37℃培養(yǎng)18h后，其結(jié)果如表1所示，表明分離的細菌生化特性符合大腸桿菌的特征。

表1 分離細菌的生化反應(yīng)

3.4 血清型鑒定結(jié)果 從不同病料中共分離致病性大腸桿菌9株，O抗原其中6株為O9，占66.7%；3株為 O2，占33.3%。

3.5 動物試驗結(jié)果 在接種細菌24～48h內(nèi)小鼠全部死亡。剖檢死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟腫脹出血，心外膜出血，從死亡小鼠的肝臟和心血中，分離得到與原分離菌株一致的革蘭陰性桿菌。對照組無異常表現(xiàn)，這說明分離菌株為致病性大腸桿菌。

3.6 藥敏試驗 采用紙片法對分離純化的大腸桿菌進行藥物敏感性試驗，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，該分離菌對卡那霉素、阿米卡星和氟苯尼考敏感；對其他幾種藥物中敏或耐藥。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗結(jié)果

4 小結(jié)

4.1 結(jié)合發(fā)病孔雀的臨床癥狀、病理剖檢、病毒及細菌分離、細菌染色鏡檢、培養(yǎng)及生化鑒定，診斷該珍禽養(yǎng)殖場孔雀所患疾病為大腸桿菌病。經(jīng)藥敏試驗篩選敏感藥物治療，本病迅速得到了控制。

4.2 大腸桿菌病是一種常發(fā)病，但是卻難于控制，這不僅因為其血清型多，各血清型間無交叉保護性，而且不同血清型以及不同地區(qū)的大腸桿菌對藥物敏感性也各不一致。該珍禽場經(jīng)常使用頭孢類藥物預(yù)防細菌性疾病，導(dǎo)致分離致病性大腸桿菌對頭孢類藥物有明顯耐藥，而對未使用的氟苯尼考、阿米卡星和卡那霉素有高度敏感性。

4.3 大腸桿菌病是一種條件性疾病，因此對本病的預(yù)防重點在于搞好環(huán)境衛(wèi)生和飼養(yǎng)管理，減少應(yīng)激刺激，避免混合飼養(yǎng)以免交叉感染。

［1］ 甘孟侯.中國禽病學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：12－13.

［2］ 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué).獸醫(yī)微生物學(xué)試驗指導(dǎo)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1991：28－30

［3］ 傅繼華.病毒學(xué)實用實驗技術(shù)［M］.濟南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，2001：47－49.

［4］ 涂凌云，全炳昭，陳如圣，等.丹頂鶴源大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗［J］.中國獸醫(yī)雜志，2010，46（2）：49－50.

［5］ 宋立，寧宜寶，張秀英，等.中國不同地區(qū)家禽大腸桿菌血清型分布和耐藥性比較研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（7）：1466－1473.

［6］ 何博.舊院黑雞致病性大腸桿的分離與藥敏試驗［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2010，233（3）：26－30.

［7］ WS/T 125－1999.紙片法抗菌藥物敏感試驗標(biāo)準［S］.