二十碳五烯酸對脂多糖處理的人臍靜脈內(nèi)皮細胞核轉(zhuǎn)錄因子κB的表達及細胞因子分泌的影響

包永琴， 馬景學(xué)， 葉存喜， 董白霞， 翟 英

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科，河北 石家莊 050000)

二十碳五烯酸對脂多糖處理的人臍靜脈內(nèi)皮細胞核轉(zhuǎn)錄因子κB的表達及細胞因子分泌的影響

包永琴， 馬景學(xué)△， 葉存喜， 董白霞， 翟 英

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科，河北 石家莊 050000)

目的探討二十碳五烯酸(EPA)對脂多糖(LPS)處理的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)表達以及VEGF、IL-1α和IL-6分泌的影響。方法體外生長良好的傳代HUVECs分為對照組、LPS組、0.030 g/L EPA+LPS處理組、0.050 g/L EPA+LPS處理組。LPS組僅加入LPS進行培養(yǎng)，EPA處理組先加入2種濃度的EPA(EPA終濃度分別為0.030 g/L和0.050 g/L)培養(yǎng)1 h，再加入LPS進行培養(yǎng)。LPS刺激6 h、12 h、24 h后，收集各組上清液，ELISA檢測上清液中VEGF、IL-1α和IL-6的分泌量；LPS刺激24 h后的沉淀細胞，用Western blotting法檢測HUVECs NF-κB p65的蛋白表達。結(jié)果與對照組相比，LPS刺激后，HUVECs NF-κB p65表達和VEGF 、IL-1α、IL-6分泌顯著升高(P<0.05)。EPA抑制LPS處理的HUVECs NF-κB p65的蛋白表達及VEGF、IL-1α和IL-6分泌，除LPS刺激后6 h， EPA處理組IL-6的分泌量與LPS組比較無顯著差異(P>0.05)外，其余均差異顯著(P<0.05)。結(jié)論LPS使HUVECs NF-κB蛋白表達增加，促進其VEGF及細胞因子表達。EPA抑制LPS處理的HUVECs NF-κB的表達，VEGF和細胞因子的分泌，為EPA應(yīng)用于各種新生血管性疾病和炎癥性疾病的防治提供了理論依據(jù)。

二十碳五烯酸； 人臍靜脈內(nèi)皮細胞； NF-κB； 血管內(nèi)皮生長因子； 細胞因子類

二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)是一種n-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)。食物中EPA主要來源于魚油、螺旋藻和微藻類。EPA對肺癌、直腸癌等多種腫瘤細胞的生長均有抑制作用[1]。EPA能調(diào)節(jié)免疫，抑制炎癥[2,3]，還能抑制血小板聚集，抗血栓和調(diào)血脂[4]等，但其中的確切機制尚不清楚。血管內(nèi)皮細胞是新生血管因子作用的主要靶細胞[5]，血管反應(yīng)又是炎癥過程的中心環(huán)節(jié)。因此，本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)為實驗對象，觀察EPA對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激HUVECs核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、白細胞介素1α(interleukin 1α, IL-1α)和IL-6的影響，初步探討EPA治療新生血管性疾病和炎癥性疾病的作用及可能機制。

材 料 和 方 法

1材料

HUVECs細胞株(Sciencell)；LPS和EPA(Sigma)；兔抗人NF-κB p65多克隆抗體(Santa Cruz)；特異性人VEGF、IL-1α和IL-6 ELISA檢測試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)。

2方法

2.1HUVECs培養(yǎng) -196 ℃液氮罐保存的HUVECs細胞株，37 ℃水浴復(fù)蘇后，800 r/min離心10 min，棄去上清后加入10 mL含20%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。第2 d進行傳代。HUVECs培養(yǎng)和鑒定方法參照張卓然等[6]和Bian等[7]的方法，經(jīng)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細胞化學(xué)鑒定陽性，倒置顯微鏡下觀察細胞呈鵝卵石樣排列，證實所培養(yǎng)的細胞為血管內(nèi)皮細胞；生長良好，且已長滿融合的HUVECs用于實驗。

2.2HUVECs培養(yǎng)及ELISA檢測 實驗HUVECs隨機分為對照組、LPS組、0.030 g/L EPA+LPS處理組、0.050 g/L EPA+LPS處理組。LPS組僅加入LPS，并使其終濃度為10 mg/L； EPA處理組先加入2種濃度的EPA(使EPA終濃度分別為0.030 g/L 和0.050 g/L)培養(yǎng)1 h，然后加入LPS(使LPS終濃度為10 mg/L),EPA和LPS的濃度參照文獻[8-11]和本實驗室預(yù)實驗結(jié)果確定。以上HUVECs接種于24孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)6個復(fù)孔，加入DMEM培養(yǎng)液于孔內(nèi)，置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，使細胞達到同步化。LPS刺激后6 h、12 h和24 h收集各組培養(yǎng)上清液, -20℃保存?zhèn)銭LISA用，用ELISA試劑盒檢測上清VEGF、IL-1α和IL-6濃度，具體步驟按說明書操作；24 h沉淀細胞備Western blotting法檢測用。

2.3Western blotting法檢測HUVECs NF-κB p65總蛋白 用PBS液洗培養(yǎng)24 h的HUVECs沉淀細胞2次，離心棄洗液，加入5倍細胞沉淀體積的預(yù)冷的懸浮緩沖液，吹打沉淀。加入等體積2×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮5 min，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣等量總蛋白，水浴式電印跡法將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上。室溫振蕩封閉膜2 h，加入1∶250兔抗人NF-κB p65多克隆抗體(Ⅰ抗)稀釋液，室溫輕搖2 h，用PBS-Tween 洗膜3次，加入1∶8 000 HRP標記的第Ⅱ抗體稀釋液，室溫振搖1 h, PBS-Tween充分洗膜，將膜浸入DAB顯色液，充分顯色，用蒸餾水洗膜，將膜轉(zhuǎn)入PBS液中觀察、照相。實驗重復(fù)3次，F(xiàn)R-980A 生物電泳圖像分析系統(tǒng)分析目的蛋白NF-κB p65和內(nèi)參照β-actin電泳條帶的灰度值，將目的條帶的灰度值與同一樣本內(nèi)參照的灰度值相比，得出目的蛋白的相對表達量。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1HUVECsNF-κBp65總蛋白

Western blotting法結(jié)果顯示，LPS組HUVECs NF-κB p65表達較對照組提高，差異顯著(P<0.05)。EPA組HUVECs NF-κB p65表達量較LPS組下降，差異顯著(P<0.05)，其下降呈濃度依賴性，見圖1。

Figure 1. The protein expression of NF-κB p65 in cultured HUVECs stimulated by LPS after 24 h. 1:10 mg/L LPS+0.050 g/L EPA; 2:10 mg/L LPS+0.030 g/L EPA; 3:10 mg/L LPS; 4: control.s.n=3. *P<0.05 vs LPS group; #P<0.05 vs 0.030 g/L EPA group.

2HUVECsVEGF分泌

ELISA檢測結(jié)果(圖2)顯示，LPS組HUVECs分泌VEGF明顯增加，與對照組比較差異顯著(P<0.01)；LPS組3個時點的VEGF分泌量差異顯著(P<0.01)；LPS組3個時點的VEGF分泌量經(jīng)SNK兩兩比較，差異顯著(均P<0.05)，即LPS呈時間依賴性增加HUVECs VEGF分泌，至24 h時VEGF分泌量為對照組的11倍。

Figure 2. The VEGF secretion in cultured HUVECs stimulated by LPS with or without EPA treatment.±s.n=6. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs LPS group.

LPS刺激后6 h、12 h和24 h，EPA處理組VEGF的分泌量均較LPS組降低，均差異顯著(均P<0.01)。SNK檢驗顯示，3個時點2種濃度的EPA均可抑制LPS刺激的HUVECs的VEGF分泌，與LPS組比較均差異顯著(均P<0.05)，但2種濃度EPA的抑制作用比較差異無顯著(P>0.05)，24 h VEGF分泌量較LPS組分別下降81.0%和82.4%，。

3HUVECsIL-1α分泌

ELISA檢測結(jié)果(圖3)顯示，LPS組HUVECs分泌IL-1α明顯增加，與對照組比較差異顯著(P<0.01,P<0.05)。LPS組3個時點的IL-1α分泌量差異顯著(P<0.01)；LPS組3個時點的IL-1α分泌量經(jīng)SNK兩兩比較，除6 h、12 h之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余任2個時點間差異顯著(P<0.05)，即LPS隨時間延長增加HUVECs IL-1α分泌，至24 h IL-1α分泌量為對照組的16倍。

LPS刺激后6 h、12 h和24 h，EPA處理組IL-1α的分泌量均較LPS組降低，差異顯著(均P<0.05)。SNK檢驗顯示，LPS刺激后12 h，2種濃度的EPA均可抑制LPS刺激的HUVECs IL-1α的分泌，與LPS組比較差異顯著(均P<0.05)，且2種濃度EPA的抑制作用差異顯著(P<0.05)；LPS刺激后6 h和24 h，2種濃度的EPA均可抑制LPS刺激的HUVECs的IL-1α分泌，與LPS組比較差異顯著(均P<0.05)，至24 h分泌量較LPS組分別下降62.7%和68.6%，但不同濃度EPA的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

4HUVECsIL-6分泌

ELISA檢測結(jié)果(圖4)顯示，LPS組HUVECs分泌IL-6明顯增加，與對照組相比差異顯著(P<0.05,P<0.01)。LPS組3個時點的IL-6分泌量差異顯著(P<0.01)；LPS組3個時點IL-6分泌量經(jīng)SNK兩兩比較，差異顯著(均P<0.05)，即LPS呈時間依賴性增加HUVECs IL-6分泌，至24 h時IL-6分泌量為對照組的2倍。

Figure 3. The IL-1α secretion in cultured HUVECs stimulated by LPS with or without EPA treatment.s. n=6. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs LPS group; △P<0.05 vs LPS+0.030 g/L EPA.

Figure 4. The IL-6 secretion in cultured HUVECs stimulated by LPS with or without EPA treatment.s.n=6. *P<0.05，**P<0.01 vs control group; #P<0.05,##P<0.01 vs LPS group; △P<0.05 vs LPS+0.030 g/L EPA.

LPS刺激后6 h， 2種濃度EPA處理組IL-6的分泌量與LPS組比較差異無顯著(P>0.05)。LPS刺激后12 h和24 h，2個濃度EPA處理組IL-6的分泌量均較LPS組降低，差異顯著(P<0.05,P<0.01)，且24 h時2種濃度EPA的抑制作用差異顯著(P<0.05)，至24 h IL-6的分泌量較LPS組分別下降40.2%和61.0%。但12 h時2種濃度EPA的抑制作用差異無顯著(P>0.05)。

討 論

血管新生影響到一些眼病的發(fā)生發(fā)展，并常導(dǎo)致嚴重視力下降，如角膜新生血管、糖尿病視網(wǎng)膜病變、新生血管性青光眼等。新生血管形成的原因主要有：缺氧、炎癥等。缺氧使組織產(chǎn)生和釋放大量新生血管形成因子，巨噬細胞等炎癥細胞也可產(chǎn)生大量的新生血管形成因子，刺激新生血管的形成。炎癥同時也是其它眼病如角膜化學(xué)燒傷和增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變等的基本病理過程或原因。

VEGF可刺激體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞增殖、遷移和體內(nèi)血管形成，是眾多新生血管形成因子中最主要的一種。VEGF主要作用于血管內(nèi)皮細胞[5],與血管內(nèi)皮細胞表面的酪氨酸激酶受體(tyrosine protein kinase receptor, TPKR)結(jié)合，通過酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，刺激內(nèi)皮細胞的分裂、增殖和移行，導(dǎo)致血管發(fā)生和血管通透性增加。IL-1 和IL-6由激活的單個核細胞[5,6]、巨噬細胞[12，13]等產(chǎn)生，是介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)的重要細胞因子[14]。NF-κB是存在于體內(nèi)多種細胞的核轉(zhuǎn)錄因子。LPS是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，是導(dǎo)致機體組織損傷和休克的重要介質(zhì)，能促進多種細胞分泌致炎細胞因子[15]。富含魚油的EPA具有抗動脈粥樣硬化[4]、抗腫瘤[1]、抗炎[3]等作用。

本實驗結(jié)果表明， LPS作用6 h、12 h、24 h引起HUVECs分泌VEGF增加，并呈時間依賴性，24 h達高峰。0.030 g/L EPA和0.050 g/L EPA均能抑制LPS誘導(dǎo)的HUVECs VEGF分泌。VEGF與內(nèi)皮細胞細胞膜上酪氨酸激酶受體結(jié)合并作用于內(nèi)皮細胞，加強血管管腔的形成[16]。因此，EPA可能通過抑制HUVECs VEGF的分泌直接發(fā)揮其抗血管生成作用。

本實驗結(jié)果表明， LPS作用6 h、12 h、24 h后HUVECs分泌IL-1α和IL-6增加，呈時間依賴性，24 h達高峰。0.030 g/L EPA和0.050 g/L EPA均能抑制LPS處理的HUVECs IL-1α和IL-6的分泌。這與Moon等[17]與LeBlanc等[18]的報道一致，即EPA有抑制致炎細胞因子分泌的作用。但EPA的抗炎作用機制仍不十分清楚。有研究表明， EPA可抑制膜受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞因子基因表達[19]。一方面n-3多不飽和脂肪酸EPA和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)抑制Toll樣受體的激活，阻斷Toll樣受體/細胞因子受體和NF-κB間信號級聯(lián)放大，抑制Toll樣受體介導(dǎo)的信號通路和基因表達，從而起抗炎作用；另一方面，EPA還抑制LPS與其Toll樣受體結(jié)合后下游信號通路的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活性，影響MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制炎癥因子基因表達，抑制致炎細胞因子如IL-1、IL-6 和 TNF-α表達[17、18]，從而減輕炎癥反應(yīng)。EPA還可抑制核受體NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：EPA通過抑制NF-κB活性，減少致炎細胞因子釋放，達到抗炎作用[15]。本研究結(jié)果表明，LPS刺激后，HUVECs NF-κB p65蛋白表達較對照組增加，0.030 g/L EPA和0.050 g/L EPA均能抑制LPS處理的HUVECs NF-κB p65蛋白表達，其蛋白表達下降程度呈濃度依賴性。

總之，LPS顯著上調(diào)HUVECs NF-κB p65蛋白表達，而NF-κB蛋白表達變化影響NF-κB的活性，進而影響靶基因表達，活化的NF-κB可介導(dǎo)HUVECs促血管生成因子VEGF，致炎細胞因子IL-1α和IL-6表達增強，導(dǎo)致細胞的增殖、炎癥和免疫反應(yīng)等，從而促進新生血管形成和炎癥反應(yīng)。EPA能降低LPS處理的HUVECs NF-κB p65蛋白表達，進而降低NF-κB活性，并抑制其VEGF 和致炎細胞因子IL-1α、IL-6分泌,從而發(fā)揮其抗血管生成作用和抗炎作用，這為EPA應(yīng)用于各種新生血管性疾病和炎癥性疾病的防治提供了理論依據(jù)。

[1] Hardman WE.(n-3) fatty acids and cancer therapy[J].J Nutr,2004,134(12 Suppl):3427S-3430S.

[2] 張敏芳,錢家麒,戴慧莉,等. 二十碳五烯酸抑制早期糖尿病腎病單核細胞趨化蛋白-1的表達[J].中國病理生理雜志, 2010,26(1):174-176,187.

[3] Singer P, Shapiro H, Theilla M,et al. Anti-inflammatory properties of omega-3 fatty acids in critical illness:novel mechanisms and an integrative perspective[J].Intensive Care Med,2008,34(9):1580-1592.

[4] Davidson MH, Stein EA, Bays HE,et al. Efficacy and tolerability of adding prescription omega-3 fatty acids 4 g/d to Simvastatin 40 mg/d in hypertriglyceridemic patients: An 8-week, randomized, double-blind, placebo-controlled study[J]. Clin Ther,2007,29(7):1354-1367.

[5] Maiti D,Xu Z,Duh EJ,et al. Vascular endothelial growth factor induces MEF2C and MEF2-dependent activity in endothelial cells[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(8):3640-3648.

[6] 張卓然.培養(yǎng)細胞學(xué)與細胞培養(yǎng)技術(shù)[M].第1版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2004.90-92.

[7] Bian F, Zhang MC, Zhu Y. Inhibitory effect of curcumin on corneal neovascularizationinvitroandinvivo[J]. Ophthalmologica, 2008,222(3):178-186.

[8] Li H, Ruan XZ, Powis SH,et al. EPA and DHA reduce LPS-induced inflammation responses in HK-2 cells: evidence for a PPAR-γ-dependent mechanism[J]. Kidney Int, 2005,67(3): 867-874.

[9] Tsuzuki T, Shibata A, Kawakami Y,et al.Conjugated eicosapentaenoic acid inhibits vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis by suppressing the migration of human umbilical vein endothelial cells[J]. J Nutr,2007,137(3):641-646.

[10]夏延平,馮 翔,陳裕明,等.EPA、DHA對人單核細胞NO的產(chǎn)生、iNOSmRNA表達及NFκB活性的影響[J].衛(wèi)生研究,2007,36(4):445-448.

[11]張敏芳,錢家麒,戴慧莉,等. 二十碳五烯酸對脂多糖刺激的內(nèi)皮細胞炎癥因子分泌的影響[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2007,27(12):1444-1447.

[12]Koto T, Nagai N, Mochimaru H, et al.Eicosapentaenoic acid is anti-inflammatory in preventing choroidal neovascularization in mice[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48(9):4328-4334.

[13]Steer SA, Scarim AL, Chambers KT,et al.Interleukin-1 stimulates β-cell necrosis and release of the immunological adjuvant HMGB1[J].PLoS Med,2006,3(2):e17.

[14]鄭 杰.炎癥.見:李玉林,唐建武 主編.病理學(xué)[M].第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2006.70-71.

[15]Zhao Y,Joshi-Barve S,Barve S,et al. Eicosapentaenoic acid prevents LPS-induced TNF-α expression by preventing NF-κB activation[J]. J Am Coll Nutr,2004,23(1):71-78.

[16]Murota SI,Onodera M, Morita I. Regulation of angiogenesis by controlling VEGF receptor[J]. Ann N Y Acad Sci,2000,902(1):208-212.

[17]Moon DO, Kim KC, Jin CY,et al. Inhibitory effects of eicosapentaenoic acid on lipopolysaccharide-induced activation in BV2 microglia[J]. Int Immunopharmacol,2007,7(2):222-229.

[18]LeBlanc CJ, Horohov DW, Bauer JE,et al.Effects of dietary supplementation with fish oil oninvivoproduction of inflammatory mediators in clinically normal dogs[J].Am J Vet Res,2008,69(4):486-493.

[19]Lee JY, Plakidas A, Lee WH,et al. Differential modulation of Toll-like receptors by fatty acids: preferential inhibition by n-3 polyunsaturated fatty acids[J]. J Lipid Res,2003,44(3):479-486.

EffectsofeicosapentaenoicacidonexpressionofnuclearfactorκBandreleaseofcytokinesinhumanumbilicalveinendothelialcellsstimulatedbylipopolysaccharide

BAO Yong-qin, MA Jing-xue, YE Cun-xi, DONG Bai-xia, ZHAI Ying

(DepartmentofOphthalmology,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China.E-mail:majingxue2003@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the effects of eicosapentaenoic acid(EPA) on the expression of nuclear factor kappa B(NF-κB) and release of vascular endothelial growth factor(VEGF), IL-1α and IL-6 in cultured human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) stimulated by lipopolysaccharide(LPS).METHODSHUVECs were obtained from cell strain and culturedinvitro. HUVECs were divided into 4 groups: control group, LPS group, 0.030 g/L EPA treatment group and 0.050 g/L EPA treatment group. The cells were cultured with LPS alone in LPS group and incubated with EPA for 1 h in the EPA pretreatment groups at the concentrations of 0.030 g/L and 0.050 g/L before LPS stimulation. Twenty-four hours after stimulated by LPS, the protein expression of NF-κB p65 in HUVECs were assessed by Western blotting analysis at different time points. The production of VEGF, IL-1α and IL-6 in cultured HUVECs was evaluated by ELISA. The effects of EPA on the protein expression of NF-κB p65 and the production of VEGF, IL-1α and IL-6 in HUVECs challenged by LPS were also determined.RESULTSCompared with control group, the protein expression of NF-κB p65 was significantly increased in HUVECs induced by LPS and was inhibited by EPA. Compared with control group, the protein expression of VEGF, IL-1α and IL-6 was dramatically increased in HUVECs induced by LPS and most of the increase was inhibited by EPA.CONCLUSIONLPS enhances the protein expression of NF-κB and the release of VEGF, IL-1α and IL-6. EPA inhibits the protein expression of NF-κB, and the production of VEGF and the inflammatory cytokines in cultured HUVECs stimulated by LPS, indicating that EPA may be useful for preventing and treating neovascular and inflammatory diseases.

Eicosapentaenoic acid; Human umbilical vein endothelial cells; NF-kappa B; Vascular endothelial growth factors; Cytokines

Q3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-032

1000-4718(2011)02-0378-05

2010-06-12

2010-11-30

△通訊作者Tel:0311-66002352; E-mail:majingxue2003@yahoo.com.cn