BCR-ABL-SEA DNA疫苗誘導(dǎo)BALB/c小鼠的免疫應(yīng)答*

高永鵬， 林 晨△， 田紅霞， 陳 琛， 秦雅楠， 周羽竝， 李揚秋

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院1 微生物與免疫學(xué)系， 2生物化學(xué)系，3血液病研究所， 廣東 廣州 510632)

BCR-ABL-SEA DNA疫苗誘導(dǎo)BALB/c小鼠的免疫應(yīng)答*

高永鵬1， 林 晨1△， 田紅霞1， 陳 琛1， 秦雅楠1， 周羽竝2， 李揚秋3

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院1微生物與免疫學(xué)系，2生物化學(xué)系，3血液病研究所， 廣東 廣州 510632)

目的了解BCR-ABL-SEA雙表達(dá)DNA疫苗誘導(dǎo)BALB/c小鼠特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答效應(yīng)。方法用已成功構(gòu)建的重組雙表達(dá)BCR-ABL 多肽和 SEA多肽的質(zhì)粒BCR-ABL-pIRES-SEA (B-P-S)免疫小鼠，間隔14 d共3次。相同方法用單表達(dá)BCR-ABL 多肽或 SEA多肽的質(zhì)粒BCR-ABL-pIRES 和SEA-pIRES免疫小鼠作對照。利用CCK-8 比色法檢測小鼠脾臟T 細(xì)胞對K562細(xì)胞株的殺傷活性；流式細(xì)胞術(shù)測定小鼠脾臟CD4+與CD8+T細(xì)胞表達(dá)情況；ELISA法檢測小鼠血清中干擾素γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素4(IL-4)生成情況；間接免疫熒光法檢測血清中抗BCR-ABL抗體。結(jié)果免疫后第7周時，雙表達(dá)重組質(zhì)粒B-P-S組小鼠脾臟CTL細(xì)胞針對K562殺傷率、血清中INF-γ含量均明顯高于單表達(dá)BCR-ABL-pIRES組和SEA-pIRES組(P<0.05)；CD4+/CD8+T細(xì)胞比值、血清中IL-4含量各組之間無明顯差異(P>0.05)；熒光顯微鏡檢測到血清中有抗BCR-ABL抗體。結(jié)論所構(gòu)建的BCR-ABL-SEA重組雙表達(dá)質(zhì)?？烧T導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答效應(yīng)。

白血??； 基因,BCR-ABL融合； 葡萄球菌腸毒素A； 疫苗,DNA

微小殘留病灶(minimal residual disease,MRD)仍然是慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)治療緩解后復(fù)發(fā)的一個重要因素,特異性免疫治療通過免疫監(jiān)測和清除殘留白血病細(xì)胞對預(yù)防CML復(fù)發(fā)以及延長生存期有重要作用[1,2]。CML患者具有特征性的BCR-ABL融合基因，研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)BCR-ABL融合基因的細(xì)胞及其融合蛋白多肽可以誘導(dǎo)T細(xì)胞克隆性增殖，由于單獨BCR-ABL多肽免疫原性較弱[3]，因此尋找適合的免疫佐劑是臨床應(yīng)用亟待解決的重大問題。本課題組前期研究已經(jīng)顯示，超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)可以有效增強多肽抗原誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞克隆[4,5]。DNA疫苗能夠同時誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫,而且具備傳統(tǒng)疫苗無法比擬的諸多優(yōu)點而成為新一代最有潛力的疫苗之一[6]。本研究是利用已成功構(gòu)建的BCR-ABL-pIRES-SEA的真核表達(dá)疫苗免疫BALB/c小鼠，進(jìn)一步分析其體內(nèi)刺激細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答效應(yīng)，為發(fā)展特異性免疫治療提供研究資料。

材 料 和 方 法

1材料

1.1質(zhì)粒 本課題組成功構(gòu)建的BCR-ABL-pIRES-SEA(B-P-S)(專利申請?zhí)枮?01010160423.1)真核雙表達(dá)重組質(zhì)粒及SEA-pIRES(S-P)和BCR-ABL-pIRES(B-P)單表達(dá)重組質(zhì)粒[7]。

1.2動物和分組 BALB/c小鼠由中山大學(xué)動物實驗中心提供(編號為SCXK20040011)，雄性，6-8周，18-22 g。隨機分為5組:(1)N組：生理鹽水；(2)P組：pIRES質(zhì)粒；(3)B-P-S組：雙表達(dá)BCR-ABL-pIRES-SEA質(zhì)粒；(4)B-P組：單表達(dá)BCR-ABL-pIRES質(zhì)粒；(5)S-P組：單表達(dá)SEA-pIRES質(zhì)粒。各組小鼠分別于第0、2、4周在雙側(cè)股四頭肌各注射1次，每次注射劑量為200 μg，免疫前1 d同一部位注射1%普魯卡因40 μL。初次免疫后第7周處死小鼠。

2方法

2.1CTL 殺傷活性實驗

① 靶細(xì)胞 K562細(xì)胞株作為殺傷性實驗的靶細(xì)胞，培養(yǎng)體系含10%滅活胎牛血清、1×105U/L青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)；NB4細(xì)胞株作為殺傷性實驗陰性對照，以檢測細(xì)胞毒作用的特異性。

② 效應(yīng)細(xì)胞 在無菌條件下，取小鼠脾臟置研磨器中加EZ-SepTMmouse 1×小鼠淋巴細(xì)胞分離液2 mL共研磨后，細(xì)胞懸液移至離心管，離心分離單個核細(xì)胞層，計數(shù)并用RPMI-1640液調(diào)整細(xì)胞2×1010cells/L上樣至96孔板，加入K562細(xì)胞株作為刺激源而進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)4 h。

③ 按效靶比為40∶1加入靶細(xì)胞，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)100 μL/well,微量混合器振蕩5 min,以促進(jìn)效、靶細(xì)胞之間接觸；同時分別設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對照組和靶細(xì)胞對照組(100 μL/well)。每組均設(shè)3個平行孔。各組于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。繼而在各孔內(nèi)加入10 μL的CCK-8試劑,在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后,以450 nm為檢測波長,600 nm 為參考波長,于酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度(A)值。

對靶細(xì)胞的殺傷百分率=

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+/CD8+T 細(xì)胞比值 直接免疫熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+和CD8+T細(xì)胞比值變化情況。收集各組小鼠誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后的T 細(xì)胞,洗滌計數(shù)后,待測100 μL細(xì)胞懸液分別加入FITC-CD4和PE-CD8標(biāo)記單抗各5 μL,其中生理鹽水組作為陰性對照組,室溫避光染色15 min。用洗滌液洗滌2次,加入終濃度2%多聚甲醛固定,流式細(xì)胞儀檢測,利用MultiSET V 1.1.1軟件進(jìn)行分析。

2.3小鼠血清中IFN-γ和IL-4測定 按試劑盒說明書操作，按1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、0 ng/L進(jìn)行對倍稀釋以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。生物素化抗體工作液配制：以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1∶100)。酶結(jié)合物工作液配制：以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1∶100)。取出所需板條，除空白孔，分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL/well)加入相應(yīng)孔中，每樣品設(shè)2復(fù)孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵箱孵育90 min,洗板4次。除空白孔外，每孔加入生物素化抗體工作液100 μL。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵箱孵育60 min,洗板4次。除空白孔外，每孔加入酶結(jié)合物工作液100 μL。封住板孔37 ℃孵箱孵育30 min。洗板4次。加入顯色劑100 μL/well，避光37 ℃孵箱孵育10-15 min,加入終止液100 μL/well，混勻后即刻在450 nm酶標(biāo)儀測定標(biāo)本的吸光度A450值(5 min內(nèi))。

2.4間接免疫熒光檢測血清中抗BCR-ABL抗體 收集對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，PBS洗滌2次，1 500 r/min離心3 min，去上清調(diào)整細(xì)胞濃度約1×109cells/L，分別加入各組小鼠血清作為Ⅰ抗，以生理鹽水組作為陰性對照。37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，離心。 加入羊抗鼠FITC標(biāo)記Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，點片。用熒光顯微鏡觀察并拍照。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1免疫小鼠CTL殺傷活性檢測

各組小鼠CTL對K562細(xì)胞和對照組NB4細(xì)胞的殺傷率見表1。對照組NS組和P組兩組之間沒有明顯差別，且組內(nèi)對2種靶細(xì)胞的殺傷率之間也無明顯差別(P>0.05)。B-P組對K562細(xì)胞殺傷活性高于對照N組,而且也顯著高于同組對NB4細(xì)胞的殺傷效果(P<0.05)。S-P組不僅可以對K562細(xì)胞有殺傷活性，同時對NB4產(chǎn)生明顯的殺傷作用，但兩者之間的殺傷活性沒有顯著差異。B-P-S組對K562細(xì)胞殺傷活性明顯高于B-P組和S-P組，而且殺傷效果高于同組對NB4細(xì)胞株的殺傷效果(P<0.05)。此外，與B-P組和S-P組對NB4細(xì)胞殺傷活性比較，B-P-S組也對NB4細(xì)胞有顯著的殺傷活性(P<0.05)。

表1 免疫小鼠CTL針對K562和NB4細(xì)胞的殺傷率

2CD4+/CD8+細(xì)胞比值變化

對小鼠CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群的百分比的影響見表2和圖2，各組間無明顯差異(P>0.05)。但B-P-S組CD4+/CD8+T 細(xì)胞比值降低趨勢比較明顯。

表2 免疫小鼠CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群的百分比變化情況

3免疫后小鼠血清中IFN-γ的檢測

結(jié)果見表3，組間兩兩比較差異顯著(P<0.01)。B-P-S組明顯高于質(zhì)粒B-P組、S-P組(P<0.05)，B-P組有升高但與陰性對照比無明顯差異。

表3 免疫后小鼠血清中IFN-γ的含量

4免疫后小鼠血清中IL-4的檢測

結(jié)果見表4，組間無明顯差別(P>0.05)。

表4 免疫后小鼠血清中IL-4的含量

5小鼠血清中抗BCR-ABL抗體的檢測

B-P-S組、B-P組K562細(xì)胞株表面有綠色的熒光，在其余各組和陰性對照組均未見到熒光，見圖2。

Figure 1. The CD4 and CD8 surface markers on the spleen T cells were detected by flow cytometry(FCM) in BALB/c mice after immunization. B-P-S group:BCR-ABL- pIRES-SEA, the reconstructed BCR-ABL- pIRES-SEA plasmids, which were developed previous in our laboratory, were injected into BALB/c mice at 14-d intervals for 3 cycles.The upper left quadrant represents CD8+T cells,while the lower right quadrant is on behalf of CD4+T cells. The CD4/CD8 ratio in B-P-S group was lower than that in negative control group.

Figure 2. The effect of the antibody against target K562 cells in BALB/c mice after immunization(×200).The surface of K562 cells indicates green fluorescence in B-P-S group and B-P group, but not in other groups. A: normal saline group under ordinary microscope; B: normal saline group under fluorescence microscope;C: P(pIRES) group under ordinary microscope; D: P(pIRES) group under fluorescence microscope; E: B-P-S(BCR-ABL-pIRES-SEA) group under ordinary microscope; F: B-P-S(BCR-ABL-pIRES-SEA) group under fluorescence microscope; G: B-P(BCR-ABL-pIRES) group under ordinary microscope; H: B-P(BCR-ABL- pIRES) group under fluorescence microscope; M: S-P(SEA- pIRES) group under ordinary microscope; N: S-P(SEA- pIRES) group under fluorescence microscope.

討 論

特異性免疫治療通過誘導(dǎo)機體細(xì)胞免疫和體液免疫為清除腫瘤微小殘留病灶成為新的治療手段。DNA疫苗能夠在體內(nèi)有效表達(dá)，并同時誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫效應(yīng)，被抗原提呈細(xì)胞攝取后在真核細(xì)胞中翻譯成蛋白質(zhì)，以多肽形式與MHC分子結(jié)合，并被呈遞到細(xì)胞表面被T細(xì)胞受體所識別，從而特異性激活T細(xì)胞引起細(xì)胞毒T細(xì)胞效應(yīng)及體液免疫效應(yīng)[8]。因此有可能成為治療CML比較理想的治療方法。

正常情況下，c-ABL蛋白主要存在于細(xì)胞的胞核內(nèi)，與細(xì)胞的凋亡有關(guān),而在CML細(xì)胞內(nèi)，BCR-ABL蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位紊亂，主要分布于胞質(zhì)中，發(fā)揮著抗凋亡作用。BCR-ABL融合基因是由t(9;22)異常核型形成，其分子生物學(xué)本質(zhì)是9號染色體長臂上的ABL基因易位至22號染色體長臂的斷裂點簇集區(qū)BCR,形成BCR-ABL融合基因,與CML的發(fā)生密切相關(guān)。其表達(dá)產(chǎn)物融合蛋白是CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)，因此，也是CML患者理想的免疫治療靶抗原。已有研究表明利用BCR-ABL融合基因構(gòu)建的DNA疫苗，能夠成功在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出特異性抗細(xì)胞毒性細(xì)胞效應(yīng)，也進(jìn)一步證明了用BCR-ABL融合基因疫苗治療CML的可行性[9]。免疫原性弱是目前BCR-ABL融合基因疫苗研究中普遍存在的問題，已有研究顯示SEA作為佐劑能夠顯著增強肽疫苗的免疫原性，可以提高疫苗的治療效果，我們前期研究也證明了SEA有增強PML-RARα多肽誘導(dǎo)外周血T細(xì)胞TCR Vβ亞家族克隆性增殖的能力，并具有增強CTL作用[4，5]。有研究表明將表達(dá)細(xì)胞因子基因與目的基因一起插入到同一質(zhì)粒中，由于二者作用的微環(huán)境相同，能夠進(jìn)一步增強DNA疫苗的免疫原性[10]，但也發(fā)現(xiàn)同一種細(xì)胞因子與不同的抗原共同免疫時其作用可能也不同，甚至出現(xiàn)相反作用[11]，而且大多數(shù)細(xì)胞因子的體內(nèi)半衰期短，活性容易受內(nèi)環(huán)境影響。因此，鑒于上述DNA疫苗的不足之處，本課題組前期構(gòu)建了BCR-ABL-SEA的真核雙表達(dá)質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后，能夠在真核細(xì)胞中正常地轉(zhuǎn)錄，并利用點雜交和SDS-PAGE等檢測技術(shù)證明了這些重組質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中成功翻譯出相應(yīng)蛋白[7]。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，檢測其體內(nèi)抗原特異性抗體和細(xì)胞免疫效應(yīng)。結(jié)果表明B-P組在效靶比40∶1條件下，誘導(dǎo)外周血T細(xì)胞對CML細(xì)胞株K562細(xì)胞表現(xiàn)出特異性的殺傷作用。S-P組在同樣的條件下也能增強T細(xì)胞對2種白血病細(xì)胞株的殺傷效應(yīng)，但缺乏特異性。B-P-S重組雙表達(dá)質(zhì)粒在相同條件下，可以誘導(dǎo)出對K562細(xì)胞特異性殺傷作用更高的T細(xì)胞，這可能是BCR-ABL融合蛋白誘導(dǎo)出特異性的T細(xì)胞克隆大量增殖,SEA與優(yōu)勢增殖的特異性T細(xì)胞克隆TCR Vβ片段非特異性結(jié)合,進(jìn)一步刺激細(xì)胞活化,并產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,放大所誘導(dǎo)的具有特異性殺傷作用的T細(xì)胞增殖。

CD4+Th細(xì)胞和CD8+Tc在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著其各自作用，因此,T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和相對比值的變化，可以成為衡量機體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)。本實驗中經(jīng)疫苗誘導(dǎo)后，對各組小鼠CD4+T和CD8+T 細(xì)胞亞群比例的檢測均沒有發(fā)現(xiàn)有明顯改變(表2)，提示SEA具有同時活化CD4+T和CD8+T 細(xì)胞作用[12]。但本實驗B-P-S組誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞活化增殖結(jié)果顯示，CD4+/CD8+T 細(xì)胞比值降低趨勢最為明顯，是否存在誘導(dǎo)后CD8+T細(xì)胞活化增殖能力更強一些？這值得進(jìn)一步研究證實。機體抗腫瘤效應(yīng)十分復(fù)雜，細(xì)胞免疫機制在機體抗腫瘤效應(yīng)機制中發(fā)揮極為重要的作用。腫瘤抗原特異性CD4+T細(xì)胞活化后，可分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ和TNF等細(xì)胞因子。我們以IFN-γ水平間接反映Th1活化增殖情況，IL-4水平反映Th2活化增殖情況。IFN-γ主要由CD4+Th1細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞所產(chǎn)生，能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等MHC-Ⅱ類抗原的表達(dá)，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識別過程。增強抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)與T細(xì)胞的相互作用，進(jìn)而增強T細(xì)胞輔助抗體和細(xì)胞毒T細(xì)胞產(chǎn)生的能力，IFN-γ也誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ類分子的作用，增強細(xì)胞毒T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力，同時，還具有巨噬細(xì)胞激活因子(macrophage activating factor, MAF)的作用，能引發(fā)巨噬細(xì)胞的殺腫瘤效應(yīng)。而IL-4屬于Th2細(xì)胞產(chǎn)生的特征性細(xì)胞因子，主要是促進(jìn)體液免疫，增強特異性和非特異性的殺傷功能[13]。它能增強B細(xì)胞對T細(xì)胞的抗原提呈作用，增加B細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)體液免疫應(yīng)答。同時能誘導(dǎo)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增殖，促進(jìn)其提呈抗原和殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。本實驗結(jié)果顯示：B-P-S重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)Th1作用更加明顯。各組小鼠血清中IL-4含量雖然沒有表現(xiàn)出明顯差異，但B-P-S組仍是最高。B-P-S組、B-P組小鼠血清中還是發(fā)現(xiàn)有抗BCR-ABL抗體。機體抗腫瘤免疫應(yīng)答中，體液免疫應(yīng)答與細(xì)胞免疫機制相互協(xié)調(diào)和補充，共同執(zhí)行免疫監(jiān)視功能，具體調(diào)節(jié)機制涉及多種因素，相互形成網(wǎng)絡(luò)共同作用產(chǎn)生最終效應(yīng)。

綜上，本研究表明所構(gòu)建的BCR-ABL-pRIES-SEA雙表達(dá)重組質(zhì)粒能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，而且較單表達(dá)BCR-ABL-pRIES質(zhì)粒的效果要好，初步評價該DNA疫苗具有一定的保護(hù)效力。DNA疫苗已經(jīng)成為新一代最有前景的疫苗之一，如何增強DNA疫苗的免疫原性是DNA疫苗領(lǐng)域亟待解決的問題, 另外，重組質(zhì)粒注射的劑量以及免疫途徑，也影響免疫的效果。本結(jié)果為進(jìn)一步研制出更安全、更有效的預(yù)防性疫苗，提供了可行性數(shù)據(jù)資料。

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ImmuneresponsesinducedbyDNAvaccineofBCR-ABL-SEAinBALB/cmice

GAO Yong-peng1, LIN Chen1, TIAN Hong-xia1, CHEN Chen1, QIN Ya-nan1, ZHOU Yu-bing2, LI Yang-qiu3

(1DepartmentofMicrobiologyandImmunology,2DepartmentofBiochemistry,3InstituteofHematology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tlinc@jnu.edu.cn)

AIM: To evaluate the immune responses induced by a DNA vaccine expressing both BCR-ABL and SEA peptides in mice.METHODSThe vaccine plasmid of BCR-ABL-pIRES-SEA, which expressed both BCR-ABL and SEA peptides and was constructed previously in our laboratory, was intramuscularly injected into BALB/c mice at 14-day intervals for 3 cycles. The plasmids of BCR-ABL-pIRES and SEA-pIRES, which were only expressed either BCR/ABL peptide or SEA peptide, were also used in the same procedure for comparison. The cytotoxicity of T-cells from mouse spleen against K562 cell line was examined by cell counting kit-8(CCK-8). The ratio of CD4+to CD8+on the harvested T cells was detected by flow cytometry. The serum levels of interferon-γ(IFN-γ) and interleukin 4(IL-4) were measured by ELISA. The antibodies against BCR-ABL were detected by the technique of immunofluorescence.RESULTSSeven weeks after immunization, the specific cytotoxicity of T-cells against K562 cells and the level of INF-γ in co-expression of BCR-ABL-pIRES-SEA group were significantly higher than those in mono-expression of BCR-ABL-pIRES group and SEA-pIRES group(P<0.05). The ratio of CD4+to CD8+on the harvested T-cells and the level of IL-4 in vaccinated mouse serum were not significantly different among the groups(P>0.05). The specific antibody against BCR-ABL was detected in BCR-ABL-pIRES-SEA group and BCR-ABL-pIRES group but not in SEA-pIRES group by indirect immunofluorescene analysis.CONCLUSIONThe recombinant BCR-ABL-pIRES-SEA vaccine induces specific humoral and cellular immune responsesinvivo.

Leukemia; Genes, BCR-ABL fusion; Staphylococcal enterotoxin A; Vaccines,DNA

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-028

1000-4718(2011)02-0361-06

2010-07-12

2010-11-30

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.06025169)；廣州市科技支撐計劃資助項目(No.2009Z1-E161)

△通訊作者 Tel：020-85220257；E-mail: tlinc@jnu.edu.cn