漿細(xì)胞CD45和CD31的表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞分化程度的關(guān)系*

歐陽(yáng)涓， 李俊勛， 劉 茵， 吳培煌

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部， 廣東 廣州 510080)

漿細(xì)胞CD45和CD31的表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞分化程度的關(guān)系*

歐陽(yáng)涓， 李俊勛△， 劉 茵， 吳培煌

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部， 廣東 廣州 510080)

目的了解反映多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞生物學(xué)行為的免疫標(biāo)記在骨髓不同階段漿細(xì)胞中的表達(dá)情況,為臨床調(diào)整治療策略和判斷疾病病程及預(yù)后提供依據(jù)。方法用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MM患者及對(duì)照組漿細(xì)胞表面相關(guān)分化抗原的表達(dá)情況，分析其在良、惡性漿細(xì)胞表達(dá)的差異，及其與原始漿細(xì)胞比例的相關(guān)性。結(jié)果MM患者漿細(xì)胞CD45和CD31表達(dá)率低于對(duì)照組漿細(xì)胞； MM細(xì)胞 CD45和CD31的表達(dá)率與原始漿細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)；CD45表達(dá)與CD31表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)。結(jié)論漿細(xì)胞CD45和CD31的表達(dá)率與MM細(xì)胞的分化程度呈正相關(guān)，其表達(dá)可能與MM的疾病進(jìn)展有一定關(guān)系。

多發(fā)性骨髓瘤; CD45; CD31; 流式細(xì)胞術(shù)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一種單克隆漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，也是血液系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤。隨著我國(guó)人口老齡化，MM發(fā)病率也有逐年增高的趨勢(shì)。MM臨床表現(xiàn)多樣且不同，患者生存期相差很大[1,2]，從幾個(gè)月到10多年不等。研究表明抗原分子表達(dá)不同的各MM細(xì)胞亞群，其增殖能力和分化潛能也迥異，從而臨床表現(xiàn)也各不相同,因此研究反映MM細(xì)胞生物學(xué)行為的免疫標(biāo)記,有助于調(diào)整治療策略和判斷疾病病程及預(yù)后[3,4]。CD45是單鏈跨膜糖蛋白，屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員，廣泛存在于造血系細(xì)胞表面。國(guó)外有研究表明CD45抗原的表達(dá)是MM的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，CD45陰性組較CD45陽(yáng)性組生存期顯著縮短[5]，但不同分化階段的MM細(xì)胞及漿細(xì)胞CD45表達(dá)情況未有深入的研究。CD31，又稱血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM-1),屬于免疫球蛋白超基因家族，是存在于正常漿細(xì)胞上的少數(shù)幾個(gè)抗原之一，是CD38的配體，正常漿細(xì)胞均為CD31陽(yáng)性。而國(guó)外有個(gè)別文獻(xiàn)[6]發(fā)現(xiàn)，免疫組化染色切片中，MM細(xì)胞不表達(dá)CD31，但未詳細(xì)闡明其表達(dá)情況與患者的病情進(jìn)展及相關(guān)預(yù)后指標(biāo)之間的關(guān)系。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析MM患者的免疫表型，初步探討CD45和CD31在MM患者的表達(dá)情況，并分析其與MM細(xì)胞分化及其它黏附分子的相關(guān)性。

材 料 和 方 法

1病例選擇

從2009年5月-2009年8月于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的MM患者16例，中位年齡57歲，均為初診，均為IgG型，其中男性7例，女性9例。另選同期骨髓漿細(xì)胞增多而細(xì)胞形態(tài)正常的患者9例作對(duì)照。

2標(biāo)本采集

所有患者行骨髓穿刺術(shù)，抽取骨髓2 mL，EDTA抗凝。

3流式細(xì)胞術(shù)

按比例分別加入CD38-FITC、CD45-APC、CD56-PE、CD19-PerCP-cy5.5、CD20-PE-cy7、CD54-PE、CD138-PerCP-cy5.5、CD31-PE及各標(biāo)記物同型對(duì)照，避光孵育20 min。每管加溶血?jiǎng)?.0 mL，避光10 min后，洗滌后棄上清，用PBS 500 μL懸浮上機(jī)。用BD FACS Canto流式細(xì)胞儀及BD FACSDiva軟件獲取7×104細(xì)胞，CD45/CD38設(shè)門分析骨髓漿細(xì)胞各種抗原的表達(dá)。CD31抗體克隆號(hào)為WM59，購(gòu)自eBioscience，其余抗體均購(gòu)自BD。CD45表達(dá)的評(píng)估參照文獻(xiàn)[5]，cMFIPC=MFIPC×100/MFILYM，余各指標(biāo)均以表達(dá)比例大于20%作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。

4骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查

取MM患者及對(duì)照組骨髓液制作涂片，瑞氏染色，計(jì)數(shù)200個(gè)漿細(xì)胞，按照形態(tài)特點(diǎn)分成原始、幼稚和成熟3類。所有骨髓涂片鏡檢工作由同一檢驗(yàn)醫(yī)師完成，并交另一檢驗(yàn)醫(yī)師復(fù)核后發(fā)報(bào)。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 13.0分析數(shù)據(jù)。MM細(xì)胞CD31和CD45表達(dá)與原始、幼稚MM細(xì)胞比例及其它黏附分子表達(dá)關(guān)系采用Spearman非參數(shù)相關(guān)分析法；MM患者與對(duì)照組CD31和CD45表達(dá)比較采用秩和檢驗(yàn)方法。

結(jié) 果

1骨髓瘤細(xì)胞CD45及CD31表達(dá)比例

如圖1所示MM患者組CD45表達(dá)最低為0.15，最高為2.5，對(duì)照組漿細(xì)胞CD45表達(dá)最低為9.2，最高14.25；MM患者組CD31表達(dá)最低為48.3%，最高為99.8%；對(duì)照組漿細(xì)胞CD31表達(dá)最低96.2%最高100%。采用秩和檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MM細(xì)胞和對(duì)照組漿細(xì)胞在CD45及CD31的表達(dá)上有顯著差異(P<0.05)。

Figure 1. Expression of CD45 and CD31.Fluorescence analysis was performed on gated cells(P1), gated by CD38/CD45. A: strong expression of CD45 in the plasma cells of control group;B: strong expression of CD45 in the plasma cells of MM group;C: relatively weak expression of CD45 in the plasma cells of MM group; D, E,F: the isotype controls; G,H,I: the expression of CD31;D, G: the isotype control and the expression of CD31 of control group, CD31 expression is strong;E,H: the isotype control and the expression of CD31 of MM group, CD31 expression is strong; F,I: the isotype control and the expression of CD31 of MM group, CD31 expression is relatively weak.

2原始漿細(xì)胞比例與骨髓瘤細(xì)胞表面CD45及CD31表達(dá)比例相關(guān)性分析

骨髓瘤細(xì)胞表面CD45及CD31的表達(dá)比例和原始漿細(xì)胞比例有較好的負(fù)相關(guān)性，Spearman相關(guān)分析顯示，相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.868及r=-0.864，呈顯著相關(guān)，P<0.01,見(jiàn)圖2。

3骨髓瘤細(xì)胞表面CD45與CD31表達(dá)相關(guān)性分析

CD31與CD45的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.817，P<0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. Correlation analysis of the percentage of plasmablast in bone marrow and the expression of CD45 and CD31.A: morphology of the plasma cells in the bone marrow of control group. The percentage of plasma cells increased,and all of the plasma cells are mature. The expression of CD45 and CD31 is strong. B: morphology of the plasma cells in the bone marrow of MM patient group. The percentage of plasma cells increased, and the percentage of plasmablast is 0%. The expression of CD45 and CD31 is strong. C: morphology of the plasma cells in the bone marrow of MM patient group. The percentage of plasma cells increased, and most of the plasma cells are plasmablast. The expression of CD45 and CD31 is comparatively weak. D: correlation analysis of the percentage of plasmablast and the expression of CD45. Spearman correlation analysis, r=-0.868，P<0.01. E: correlation analysis of the percentage of plasmablast and the expression of CD31. Spearman correlation analysis,r=-0.864，P<0.01. F: correlation analysis of the expression of CD45 and CD31. Spearman correlation analysis, r=0.817, P<0.01.

討 論

流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MM進(jìn)行免疫分型，能夠準(zhǔn)確、客觀地反映漿細(xì)胞的抗原分子表達(dá)，為鑒別良、惡性漿細(xì)胞、評(píng)估病情提供依據(jù)，因而廣泛應(yīng)用于臨床MM檢測(cè)中。傳統(tǒng)的CD45/SSC設(shè)門檢測(cè)MM免疫表型，MM細(xì)胞與有核紅細(xì)胞不易區(qū)分，特別是在MM細(xì)胞比例低時(shí)，不能準(zhǔn)確分析MM細(xì)胞的抗原表達(dá)。CD38/SSC也是常用的檢測(cè)MM免疫表型的方法，但由于CD38抗原除了表達(dá)在漿細(xì)胞外，在激活的T細(xì)胞、B細(xì)胞、造血祖細(xì)胞上也有表達(dá)，因此這種設(shè)門方法也會(huì)使MM細(xì)胞抗原檢測(cè)受到這些細(xì)胞的干擾。本研究采用CD45/CD38設(shè)門策略對(duì)MM進(jìn)行免疫分型，提高了對(duì)克隆性細(xì)胞群的識(shí)別，這種設(shè)門方法也是國(guó)際上分析MM細(xì)胞廣泛應(yīng)用的設(shè)門方法[7]。

漿細(xì)胞是B細(xì)胞分化發(fā)育的終末階段，在B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化的過(guò)程中，許多B細(xì)胞分化抗原丟失，目前多認(rèn)為正常漿細(xì)胞的免疫表型為CD38+CD138+CD54+CD20+CD19+CD56-，MM細(xì)胞的免疫表型為CD38+CD138+CD54+CD19-CD56+/-CD20+/-[8，9]，與本研究一致。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)MM細(xì)胞與腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)的抗原表達(dá)具有異質(zhì)性的特點(diǎn)，特別體現(xiàn)在CD45和CD31的表達(dá)上：從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，MM患者漿細(xì)胞CD45和CD31表達(dá)率低于對(duì)照組漿細(xì)胞，且原始MM細(xì)胞的CD45和CD31表達(dá)率低于分化較成熟的MM細(xì)胞。在CD31在表達(dá)強(qiáng)度上，我們與報(bào)道存在一定差異：Govender等[10]研究也發(fā)現(xiàn)，30例患者的良性或反應(yīng)性漿細(xì)胞均為CD31陽(yáng)性，而20例MM患者無(wú)論自骨髓或髓外取材，其漿細(xì)胞均不表達(dá)CD31分子。而本研究結(jié)果顯示，盡管MM細(xì)胞CD31相對(duì)低表達(dá)，但并未消失。分析本研究與前人研究存在差異的原因可能有：(1)病例：國(guó)人與西方人群可能存在人群差異，病人的年齡、性別及疾病嚴(yán)重程度也可能引起差異；(2)取材：骨髓取材部位的不一致可能導(dǎo)致明顯差異，彼實(shí)驗(yàn)有自髓外取材，故有可能導(dǎo)致出現(xiàn)陰性結(jié)果；(3)儀器、方法：我們采用較為先進(jìn)的六色流式細(xì)胞儀，通過(guò)CD45/CD38設(shè)門進(jìn)行分析，靈敏度和特異性都很高，能較準(zhǔn)確地反映CD31的表達(dá)情況。而Govender等[10]采用的免疫組織化學(xué)染色只對(duì)局部病變組織細(xì)胞進(jìn)行染色檢查，檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量有限，且靈敏度相對(duì)較低，對(duì)患者總體漿細(xì)胞CD31表達(dá)的反映能力與流式細(xì)胞分析有一定差異。

有研究表明，在MM細(xì)胞克隆內(nèi)部，以CD45的表達(dá)分群，最能體現(xiàn)亞群之間生物學(xué)行為的區(qū)別[11]。CD45是B細(xì)胞活化的必要條件，也是免疫細(xì)胞上的一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)閾調(diào)節(jié)劑。我們知道IL-6是MM細(xì)胞重要的生長(zhǎng)因子，正常漿細(xì)胞在IL-6的作用下不發(fā)生增殖，而MM細(xì)胞在IL-6的作用下發(fā)生增殖；IL-6誘導(dǎo)增殖需要Scr激酶的活化，而該酶的活化與CD45表達(dá)有關(guān)。因此在疾病早期MM細(xì)胞CD45的表達(dá)對(duì)于腫瘤增殖很重要。而關(guān)于MM腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的研究[11]提示，CD45弱的MM細(xì)胞顯示一種更強(qiáng)的血管新生、髓外傳播和克隆生成能力，而且不易凋亡，是MM進(jìn)展到疾病終末期的表現(xiàn)。CD31在MM的發(fā)病過(guò)程中也起到了重要作用。Vallario等[6]認(rèn)為CD31和CD38的同質(zhì)性及異質(zhì)性結(jié)合與腫瘤惡性進(jìn)展密切相關(guān)。而Tang等[12]的研究也發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的CD31參與介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程。此外有研究表明，CD45強(qiáng)表達(dá)的MM細(xì)胞是IL-6的靶細(xì)胞，而有著高克隆生成能力的CD45弱表達(dá)細(xì)胞是IGF-1的靶細(xì)胞，因此更好地理解MM細(xì)胞CD45、CD31的表達(dá)有利于判斷疾病的進(jìn)展情況以及臨床選擇相應(yīng)的多層次的治療方法。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)CD45和CD31的表達(dá)率與原始漿細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)。Vallario等[6]也曾發(fā)現(xiàn)MM的CD31表達(dá)率與原始漿細(xì)胞有關(guān)。其將MM分為原始漿細(xì)胞型與成熟漿細(xì)胞型后，發(fā)現(xiàn)原始漿細(xì)胞型MM患者瘤細(xì)胞CD31陰性，而成熟漿細(xì)胞型則為陽(yáng)性表達(dá)。但我們的實(shí)驗(yàn)中只存在CD45、CD31相對(duì)低表達(dá)，并無(wú)陰性表達(dá)情況出現(xiàn)。較之將MM絕對(duì)的分為原始漿細(xì)胞型與成熟漿細(xì)胞型的方法，我們將CD45、CD31的表達(dá)比例與形態(tài)學(xué)中原始、幼稚細(xì)胞比例進(jìn)行相關(guān)性分析的方法明顯更優(yōu)。另外，盡管采用的單克隆抗體在克隆號(hào)和標(biāo)記物均有差別，但由于本研究采用了同型對(duì)照等質(zhì)量控制措施，出現(xiàn)明顯系統(tǒng)誤差的可能性較小。因而我們可以推斷，分化越差、形態(tài)越幼稚的漿細(xì)胞比例越高，意味著患者疾病進(jìn)展越后期，患者的預(yù)后也越差。同時(shí)也可以提示，在沒(méi)有條件開展流式細(xì)胞分析的情況下，形態(tài)學(xué)檢測(cè)時(shí)MM細(xì)胞的成熟度對(duì)病程、預(yù)后的判斷有重要參考價(jià)值。

MM細(xì)胞黏附分子的相關(guān)分析中我們發(fā)現(xiàn)，CD45與CD31的表達(dá)呈正相關(guān)，提示CD45與CD31可能共同參與MM的疾病進(jìn)展。已有文獻(xiàn)[13]證實(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)與CD45弱表達(dá)的MM細(xì)胞髓內(nèi)血管生成關(guān)系密切。而我們也注意到以往一些研究腫瘤的文獻(xiàn)論及CD31時(shí)，也認(rèn)為其與腫瘤的血管生成相關(guān)。Nelson等[14]和Harvey等[15]的研究揭示了CD31在某些腫瘤中介導(dǎo)血管生成的機(jī)制：血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)出芽方式形成新的毛細(xì)血管，CD31表達(dá)使瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞黏附，促使基質(zhì)金屬蛋白酶激活，同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)和血管基膜被降解，從而使腫瘤新生血管出芽形成新的血管。從CD31生成血管機(jī)制來(lái)看，其和VEGF生成血管的相關(guān)性也很大。但在MM中CD31是否參與腫瘤新生血管，其與CD45是否存在協(xié)同作用尚待進(jìn)一步研究。

我們知道，MM是B細(xì)胞起源的幼稚與成熟細(xì)胞構(gòu)成的漿細(xì)胞異常增生惡性腫瘤，而本研究顯示原始漿細(xì)胞比例高的MM患者其CD45和CD31表達(dá)也相對(duì)較低，因而，我們推測(cè)可能是骨髓漿細(xì)胞惡變導(dǎo)致原始、幼稚漿細(xì)胞比例明顯升高，因而CD45和CD31表達(dá)下降，分化程度差的MM細(xì)胞CD45和CD31表達(dá)量下降，分化程度好的MM細(xì)胞CD45和CD31表達(dá)量則相對(duì)較高。這其中是否存在某種致病基因的調(diào)控表達(dá)，又或者還有其它影響CD45和CD31表達(dá)的因素，這些都需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。同時(shí)也提示我們以后從分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及遺傳學(xué)等方向更深層地研究CD45和CD31在MM疾病進(jìn)展中的作用機(jī)制。

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ExpressionofCD45andCD31indifferentiationstagesofmultiplemyeloma

OUYANG Juan, LI Jun-xun, LIU Yin, Wu Pei-huang

(DepartmentofLaboratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:abericc@tom.com)

AIM: To provide information of progression, prognosis and treatment strategy for multiple myeloma(MM) by determining the expression levels of CD45 and CD31 on plasma cells in different differentiation stages.METHODSThe expression levels of CD45 and CD31 in bone marrow plasma cells in MM patients were determined by the technique of six-color flow cytometry. The bone marrow plasma cells from the patients of bone marrow plastcytosis(the cell morphology was normal) were used as control. The correlated immunophenotyping data with the percentage of plasmablast were analyzed.RESULTSThe expression of CD45 and CD31 in MM group was lower than that in control group. In MM group, the expression of CD45 and CD31 on plasma cells was negatively correlated with the percentage of plasmablast, and the expression of CD45 was positively correlated with that of CD31.CONCLUSIONThe expression of CD45 and CD31 may be correlated with the differentiation stages of plasma cells, and is possibly associated with the progression of multiple myeloma.

Multiple myeloma; CD45; CD31; Flow cytometry

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-015

1000-4718(2011)02-0288-05

2010-05-31

2010-11-19

中山大學(xué)2009年學(xué)生暑期科研基金資助項(xiàng)目

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白細(xì)胞介素-6和人角膜緣干細(xì)胞龕：上皮細(xì)胞和間質(zhì)組織間相互作用的中介

有一種關(guān)于人角膜緣上皮(human limbal epithelial, HLE)更新和損傷后修復(fù)的假說(shuō)認(rèn)為：存在于基底部的角膜緣上皮干細(xì)胞(limbal epithelial stem cells, LESCs)維持著角膜緣上皮的正常更新和損傷后修復(fù)。由于不含血清的培養(yǎng)基可以模擬角膜緣龕內(nèi)的微環(huán)境，英國(guó)科學(xué)家首次利用這種不含血清的培養(yǎng)基建立了體外培養(yǎng)模型來(lái)研究HLE細(xì)胞和有絲分裂活躍的角膜緣成纖維細(xì)胞之間的相互作用。將HLE細(xì)胞與角膜緣成纖維細(xì)胞以3∶1的比例聯(lián)合，可見(jiàn)干細(xì)胞標(biāo)記物ABCG2和p63α表達(dá)增強(qiáng)，集落保存完整。用不含血清的，且HLE細(xì)胞與角膜緣成纖維細(xì)胞以3∶1比例混合培養(yǎng)體系(3.1SF)與加入成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑和血清的HLE細(xì)胞培養(yǎng)體系(金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)體系)作比較，發(fā)現(xiàn)IL-6在3.1SF培養(yǎng)體系中表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，IL-6誘導(dǎo)HLE細(xì)胞中的STAT3磷酸化呈時(shí)間依賴性，從而通過(guò)STAT3途徑來(lái)調(diào)節(jié)HLE細(xì)胞的集落形成。如果抑制3.1SF體系中STAT3和IL-6的表達(dá)，HLE細(xì)胞的集落形成效率就顯著降低。這表明LESC龕中的IL-6介導(dǎo)STAT3途徑可以維持HLE細(xì)胞保持其祖細(xì)胞樣表型及增殖能力。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)了一個(gè)體外模型來(lái)探究與LESCs相關(guān)的細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，說(shuō)明存在于LESCs龕結(jié)構(gòu)基底的角膜緣上皮細(xì)胞和基質(zhì)中的成纖維細(xì)胞之間有著緊密聯(lián)系的空間分布特征。

Stem Cell Res，2010, 5(3):188-200(李麗娜)